Concepto de sensibilidad y especificidad analítica y clínica

Vamos a abordar los conceptos de sensibilidad y especificidad analíticas así como los de sensibilidad y especificidad clínicas. La sensibilidad analítica es la cantidad más pequeña de sustancia que se puede detectar en una muestra, de manera confiable, mediante un ensayo (límite de detección). En términos prácticos, para medir la sensibilidad analítica de la prueba molecular para SARS CoV-2 se determina la cantidad mínima de ácido ribonucleico (ARN) que la prueba detectará 95 de cada 100 veces. La especificidad analítica es la capacidad del ensayo para detectar sólo la sustancia deseada en una muestra sin reacción cruzada con otras sustancias. Sin embargo, estas definiciones difieren con los conceptos de sensibilidad y especificidad clínica (el porcentaje de pacientes enfermos que dan positivo y no enfermos que tienen resultados negativos, respectivamente). Una prueba con buena sensibilidad y especificidad analítica no necesariamente tiene buena sensibilidad y especificidad clínica⁴. Lamentablemente, el rendimiento clínico de las pruebas moleculares para detectar SARS-CoV-2 no puede conocerse hasta que comprendamos quién está realmente infectado y quién no.

Hasta el momento el diagnóstico de laboratorio de COVID-19 se puede realizar mediante tres métodos. El recomendado por todas las agencias internacionales, e incuestionable, es la detección molecular de ARN viral en muestras respiratorias^5,6. Luego encontramos los métodos rápidos de detección de antígeno del virus en muestras respiratorias y, por último, los métodos serológicos que buscan la respuesta de anticuerpos de tipo IgM, IgA, IgG o totales. Los diversos métodos presentan diferente sensibilidad y especificidad clínica. A su vez, en el proceso diagnóstico, esta performance depende de la calidad de la muestra y del día en que la misma se colecta, en relación al día de inicio de los síntomas.

Detección molecular de SARS-CoV-2

Como se citó anteriormente, la utilización de la detección molecular del ARN viral como prueba diagnóstica es incuestionable, dado su excelente desempeño analítico. Cabe destacar que la sensibilidad y especificidad analíticas de la mayoría de las técnicas de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) son excelentes⁷.

Sin embargo, cuando se considera el proceso diagnóstico completo partiendo desde la recolección de la muestra, la sensibilidad clínica desciende en función del tipo y la calidad de muestra, el transporte y el almacenamiento de ésta, así como la etapa evolutiva de la enfermedad^8,9.

Para las pruebas de diagnóstico molecular inicial de SARS-CoV-2, el CDC de Estados Unidos recomienda colectar y analizar muestras del tracto respiratorio superior. Estas muestras comprenden el hisopado nasofaríngeo y/o orofaríngeo y/o nasal, presentando el primero mejor sensibilidad y siendo el de preferencia⁵. Se pueden utilizar otras muestras como el aspirado nasofaríngeo, expectoración, aspirado traqueal y lavado bronquioloalveolar^5,6.

Preanalítica

El proceso diagnóstico comienza con la indicación del estudio. Sin entrar en los distintos enfoques para indicar los estudios, entendemos que la indicación debe ser pautada por un consenso entre médicos prescriptores y profesionales del laboratorio clínico. Particularmente, en esta pandemia, han realizado un importante aporte los grupos de expertos Intercátedra de la Universidad de la República¹⁰, así como el MSP cumpliendo este último un rol importante en la articulación, coordinación y definición de pautas.

Recolección de muestra

Este procedimiento, como fue citado, tiene un rol preponderante en el éxito de la prueba diagnóstica, por lo tanto su realización deberá cumplir con los mejores estándares de calidad. Para la recolección adecuada de la muestra debemos plantearnos tres elementos importantes.

El aspirado nasofaríngeo (ANF) está especialmente indicado en niños menores de 2 años. Este se realiza con una sonda asociada a un frasco o tubo trampa. En este caso, se puede enviar el aspirado si se prevé un procesamiento antes de las 24 horas de recolectada la muestra, pero es recomendable luego de realizar el ANF propiamente dicho, aspirar medio de transporte viral al tubo trampa. De una manera similar se haría con otras muestras, como el aspirado traqueal o lavado bronquioloalveolar, indicados en pacientes sometidos a ventilación mecánica invasiva⁴. Las muestras colectadas de esta manera no pueden ser compartidas para uso de detección de otros virus respiratorios, salvo se efectúe en el propio laboratorio donde se realice las búsqueda de SARS-CoV-2 y se realicen alícuotas en forma segura.

Una vez que tenemos la muestra en el tubo, debemos asegurarnos que esté rotulado con los datos filiatorios del paciente. Muchos laboratorios utilizan etiquetas con código de barras. Para el transporte interno, el tubo se debe colocar en doble embolsado, mediando antisepsia de manos entre embolsado primario y secundario. Este transporte debería realizarse en recipiente rígido, cerrado con tapa, manteniendo el tubo en posición vertical. En el caso de muestras que deben salir fuera de la institución se recomienda el triple envase, reglamentado en el anexo 4 del decreto 129/005¹⁸. Las muestras deben transportarse al laboratorio a una temperatura entre 2 ºC y 8 °C, destacando que la la muestra debería procesarse antes de las 72 horas desde recolección, si se utiliza medio de transporte viral y dentro de las 24 horas de colectada si se utiliza SF o PBS⁵. Sin el medio de transporte o almacenamiento adecuado, las muestras se degradan. Esto es especialmente cierto para el ARN que se detecta mediante una prueba de RT-PCR. El ARN es menos estable que el ácido desoxirribonucleico (ADN), por lo que si una muestra no se transporta o almacena adecuadamente, aumenta el riesgo de un resultado RT-PCR falso negativo.

Una vez que la muestra llega al laboratorio, se realizan los controles habituales preanalíticos de la muestra. La conservación dentro del laboratorio también debe realizarse a temperatura entre 2 ºC y 8 °C hasta poder iniciar el procesamiento. El procesamiento inicial (antes de la inactivación) de todas las muestras debe realizarse en cabina de bioseguridad, debidamente mantenida y validada¹⁹.

Analítica

El procedimiento analítico dependerá de las características del laboratorio, de la capacitación del personal así como del equipamiento existente. La detección molecular comprende dos procedimientos: la extracción del ARN y posteriormente RT-PCR.

Extracción de ARN

Esta parte del proceso analítico define, en muchas ocasiones, las características del flujo de trabajo del procedimiento completo. En base al equipamiento de extracción de ARN, podemos clasificar a los equipos automatizados en equipos de baja, mediana y alta capacidad de procesamiento en función de la cantidad simultánea de muestras capaz de procesar. Los equipos de baja capacidad presentan en general una respuesta rápida (aproximadamente tres horas) para un bajo número de muestras (una a cuatro muestras); sin embargo, los equipamientos de alta capacidad presentan un tiempo de procesamiento más prolongado (aproximadamente ocho horas) pero con número de muestras procesadas significativamente mayor (96 muestras). En general, en este último grupo el procesamiento se realiza en tandas, lo que implica juntar una determinada cantidad de muestras para luego iniciar el proceso analítico. Ante la carencia de insumos para algunos equipos de extracción de ARN automatizados, cabe señalar como una alternativa válida la utilización de procedimientos de extracción manual, aunque este tipo de metodología debe enmarcarse en un riguroso sistema de trazabilidad, capacitación del personal técnico así como la utilización de kits comerciales validados para este fin.

RT-PCR

Este proceso comprende la etapa de retrotranscripción (RT) y la etapa de amplificación. La RT puede realizarse de forma separada o unida en un mismo paso a la segunda, según el protocolo o kit utilizado. Para comprender los diferentes protocolos utilizados en la etapa de la amplificación de SARS-CoV-2 debemos comprender el contenido genético del virus, el cual se observa en la (figura 1). Desde el inicio de la circulación e identificación del SARS-CoV-2 se comenzaron los trabajos de puesta a punto de protocolos para la detección del virus en diferentes centros académicos y científicos del mundo. La OMS realizó una evaluación y recomienda la utilización de los protocolos que se observan en la (tabla 1).

Figura 1: Genes de SARS-CoV-2 y dianas moleculares utilizadas en los protocolos moleculares. El genoma codifica dos grandes genes ORF1a y ORF1b que codifican 16 proteínas no estructurales, dentro de las cuales se encuentra la RNA polimerasa-RNA dependiente (RdRp). Los genes estructurales codifican la proteína Spike o espícula (S), la de envoltura (E), la de membrana/matriz (M) y la de nucleocápside (N). 

Tabla 1: Protocolos de amplificación respaldados por Organización Mundial de la Salud. 

Los protocolos citados presentan diferentes objetivos moleculares, y a su vez los mismos tienen pequeñas diferencias en su sensibilidad analítica²⁰. Sin embargo, todos muestran un muy buen desempeño para el diagnóstico de este virus. Si el límite de detección (LoD) para una prueba es demasiado alto, los pacientes infectados con SARS-CoV-2 pueden no dar positivo, lo que lleva a una alta tasa de resultados falsos negativos. Si el LoD para una prueba es demasiado bajo, entonces la contaminación puede convertirse en un problema importante, ya que la prueba detectará las cantidades más pequeñas de ARN viral, lo que conducirá a resultados positivos falsos (es decir, personas que no están infectadas con SARS-CoV- 2 darán positivo en lugar de negativo). El LoD está disponible en las instrucciones de uso de las pruebas de SARS-CoV-2 comerciales.

Aunque la recomendación para la confirmación de caso establece la detección de dos objetivos moleculares positivos (por ejemplo, N y RdRp o E y RdRp), la OPS ha recomendado que, una vez establecido el virus en la región o país, es suficiente la detección de un solo objetivo molecular para confirmar el diagnóstico⁹. Cabe advertir que si bien la mayoría de los objetivos moleculares presentan alta sensibilidad analítica, RdRp tiene una sensibilidad algo menor al resto, por lo que su utilización como único objetivo molecular debe desaconsejarse^20). En Uruguay, investigadores de la Universidad de la República y del Instituto Pasteur desarrollaron una prueba de RT-PCR²¹. Esta prueba es comercializada por la empresa Atgen y detecta secuencias específicas del gen que codifica para la proteína N de la nucleocápside viral²².

Posanalítica

La interpretación de las pruebas moleculares se debe hacer con prudencia. A pesar de que se han revelado algunas correlaciones, las cargas virales determinadas por RT-PCR no deben utilizarse para indicar la gravedad de la infección o para controlar la respuesta terapéutica^2,11,23. Sin embargo, valores bajos de Ct (umbral de ciclo) indican altas cargas virales y pueden usarse como una indicación de mayor transmisibilidad²⁴. Ct es la intersección entre una curva de amplificación y una línea de umbral. Es una medida relativa de la concentración del objetivo en la reacción de PCR en tiempo real.

La interpretación de los resultados se debería realizar valorando el contexto clínico-epidemiológico que presenta el paciente, especialmente en aquellos que requieran internación. Los resultados negativos en un escenario de alta sospecha deben obligarnos a valorar las posibles causas de falsos negativos. Pueden aparecer falsos negativos en las siguientes circunstancias^8,9.

Además de estos aspectos preanalíticos también puede haber factores analíticos relacionados con la aparición de falsos negativos. En ese sentido, la sensibilidad podría verse afectada por mutaciones virales en los sitios objetivo, así como por la presencia de inhibidores presentes en la muestra. Ambas situaciones, hasta el momento, fueron muy poco frecuentes. Sin embargo, en un estudio que analizó 373 secuencias genéticas de virus SARS-CoV-2 de Latinoamérica, incluyendo 11 de Uruguay, se demostró la presencia de cambios en las regiones del gen N que podrían impedir un diagnóstico molecular preciso²⁵. En cambio, la región del gen E parece mantenerse conservada, por lo que los autores la recomiendan como candidata ideal para la detección de primera línea en Latinoamérica²⁵. En Europa, por el contrario, ya se ha detectado falla en la detección del gen E debido a una mutación²⁶. Por tanto, a pesar de las recomendaciones de la OPS de investigar un objetivo único, a la luz de estos trabajos resulta riesgoso confiar en un ensayo dirigido a una única secuencia del genoma viral. También se pone de manifiesto la necesidad de mantener la vigilancia, a través de secuenciación completa, de SARS-CoV-2 con el objetivo de buscar variantes que interfieran con la capacidad de detección de las pruebas de RT-PCR. Finalmente, sería recomendable que los fabricantes fueran transparentes sobre los cebadores y las sondas utilizadas, ya que esto permitiría que las variantes problemáticas se identificaran más fácilmente a partir de las secuencias virales disponibles.

En los ensayos moleculares el hallazgo de falsos positivos es muy poco frecuente. Estos podrían deberse a error preanalítico o contaminación cruzada entre muestras durante el procesamiento analítico⁸.

Luego de la interpretación de los resultados, se realiza el informe escrito con los resultados obtenidos y la firma del profesional que se responsabiliza por los resultados²⁷.

Detección de antígenos virales

Al día de estar realizando este manuscrito, estas pruebas no están disponibles en nuestro país. Sin embargo, el desarrollo de anticuerpos monoclonales contra la proteína de nucleocápside es la base de los métodos rápidos de detección de antígenos de SARS CoV-2 en muestras respiratorias²⁸.

En un estudio, aún sin revisión de pares, este tipo de ensayo mostró una sensibilidad de 50% cuando la RT-PCR fue positiva y de 82,2% frente a un Ct < 25. La especificidad reportada fue de 100%²⁹. La SEIMC emitió recomendaciones señalando que los ensayos preliminares realizados con este tipo de pruebas, disponibles en España, mostraron una sensibilidad inferior a 30% y una especificidad de 100%. La Sociedad afirmó que estos resultados impedirían su introducción en la rutina⁸. Por otra parte, desconocemos la cinética de detección de antígenos, presuponemos que sería similar a la del ARN viral⁹. Por tanto, a pesar de los prometedores resultados de algunos trabajos, cualquier tipo de prueba de este tipo que se fuera a comercializar debería pasar por un proceso de verificación con muestras respiratorias. Si se verifica su alta especificidad podría utilizarse en aquellos pacientes sintomáticos que requieran internación. Por otro lado, dada la sensibilidad reportada, solo sería de utilidad en aquellos casos que diera positiva. Es claro que si esta prueba da negativa, se debe realizar el ensayo molecular.

Las ventajas de este tipo de ensayo es que se trataría de pruebas rápidas que se podrían realizar en cualquier laboratorio en condiciones de bioseguridad adecuadas⁸.

Detección de respuesta inmune

Introducción

Generalmente en las infecciones virales, alrededor del inicio de los síntomas, los leucocitos inician el proceso de fabricar anticuerpos contra diferentes estructuras virales. Al principio estos anticuerpos, de tipo IgM, son bastante inespecíficos, lo cual podría dar lugar a reacciones cruzadas. Estos anticuerpos son transitorios y se tornan indetectables luego de algunas semanas. Los anticuerpos de tipo IgA, característicos de las secreciones mucosas, tienen una cinética de aparición similar a los IgM³⁰. A lo largo del tiempo la respuesta inmune madura, se hace más específica contra antígenos propios de SARS CoV-2. Igual hay posibilidad que estos anticuerpos de tipo IgG, aún, reaccionen contra antígenos presentes en la misma familia de virus. Sin embargo, la aparición de IgG indica que el paciente se ha infectado con el virus y ha montado una respuesta inmune contra éste. Solo una publicación realizada en modelo animal y aún sin revisión de pares, establece que la respuesta inmune protege contra la reinfección³¹. Por tanto, aún falta evidencia para afirmar que la respuesta inmune es protectora.

Pruebas serológicas

Las pruebas serológicas que identifican IgA, IgM, IgG o incluso anticuerpos totales contra SARS-CoV-2 se realizan en muestras de sangre, suero o plasma. Estas pruebas son menos complejas de realizar que las pruebas moleculares. Sin embargo, no son útiles para diagnosticar infecciones en etapa aguda³². La respuesta de anticuerpos a la infección tarda un par de semanas en ser detectables de manera confiable³⁰. Los resultados negativos no excluyen la infección por SARS-CoV-2, particularmente en pacientes con exposición reciente al virus. Existen estudios publicados que utilizaron sustratos antigénicos variados y elaborados en cada laboratorio. Estos incluyeron: proteína de nucleocápside (N)²⁹, combinación de proteína N más proteínas de espícula²³ y otros utilizaron solo proteínas de espícula³².

Para valorar la especificidad de los ensayos serológicos, el estudio de Guo y colaboradores³⁰ utilizó plasmas con anticuerpos contra los coronavirus humanos -229E, -NL63, -OC43, -HKU1, y SARS-CoV. La prueba serológica para SARS-CoV-2 solo mostró reactividad cruzada con el plasma que tenía anticuerpos contra SARS-CoV, pero no hubo reactividad frente a los otros coronavirus humanos³⁰. Quitando esta situación la prueba demostró alta especificidad. En cuanto a la sensibilidad, IgM mostró 76% de sensibilidad al día 7 desde inicio de síntomas, en casos confirmados por método molecular. La media de aparición de IgM fue el día 5 desde inicio de los síntomas con un intervalo intercuartílico de 3-6 días. La IgG mostró una sensibilidad de 78%. La media de aparición de IgG fue el día 14 desde el inicio de los síntomas con un intervalo intercuartílico de 10-18 días. En el estudio de Zhao J y colaboradores³² la media de aparición de IgM fue el día 12 y mostró una sensibilidad de 82,7%, con gran variación en los días de aparición de respuesta. En el caso de IgG la media de aparición fue el día 14 con una sensibilidad de 64,7%.

Tipos de pruebas serológicas comercializadas

En cuanto a los tipos de pruebas comercializados, hasta el momento, a nivel mundial, se han comercializado tres tipos de pruebas.

Hasta el 24 de junio de 2020, la US Food and Drug Administration (FDA) ha emitido autorizaciones de uso de emergencia (EUA) a varias pruebas serológicas. Mayoritariamente se trata de ensayos automatizados por quimioluminiscencia. Pero también ensayos de ELISA y pruebas rápidas que detectan IgM e IgG³³. EUA implica que la empresa comercial ha enviado a FDA información sobre el desempeño del ensayo para su revisión y aprobación.

El FIND, a través de varias instituciones colaboradoras, evaluó varios ensayos rápidos de detección de IgM/IgG obteniendo resultados muy variables en relación tanto a sensibilidad como especificidad³⁴.

Dados estos hallazgos se hace necesario evaluar los ensayos a comercializar en Uruguay para conocer su desempeño analítico y clínico.

Si contáramos con ensayos serológicos con un buen desempeño, serían de utilidad cuando los pacientes consultan con complicaciones tardías de la enfermedad, en casos de RT-PCR falsamente negativa, dado que la eliminación viral disminuye con el tiempo⁸.

Por otra parte, ensayos serológicos que evalúen con precisión la infección previa y la inmunidad al SARS-CoV-2 serán esenciales para los estudios epidemiológicos, la vigilancia continua, los estudios de vacunas y potencialmente para la evaluación del riesgo de los trabajadores de la salud^8,35.