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Introducción:
La coenurosis es una enfermedad parasitaria del sistema nervioso central que afecta principalmente a ovinos aunque puede ser hallada en otros rumiantes así como en equinos, suinos y humanos (Soulsby, 1982). Esta enfermedad es causada por Coenurus cerebralis, forma larvaria(metacestode) de Taenia multiceps quien habita en el intestino de cánidos domésticos y salvajes(Soulsby, 1982). Los hospederos definitivos (cánidos) expulsan los proglótidos grávidos o huevos con las heces. Por otra parte, los hospederos intermediarios se infectan luego de ingerir los huevos con las pasturas o agua, liberándose las oncosferas en el intestino (Sharma y Chauhan, 2006). Las mismas penetran la mucosa intestinal y a través del torrente sanguíneo llegan al encéfalo y médula espinal donde se desarrolla elmetacestode (Gardiner y Poyinton, 1999).Dicha larva se localiza mayormente en los hemisferios cerebrales y médula espinal,aunque raramente invade otros tejidos (Sharma y Chauhan, 2006).
Los síntomas en los animales varían dependiendo de la ubicación del quiste, su tamaño y la compresión del cerebro (Sharma y Chauhan, 2006). Las manifestaciones clínicas se asocian con depresión moderada, incoordinación, caminar en círculos y pérdida total o parcial de la visión (Avcioglu y col., 2012; Özkan y col., 2011).La infección por Coenurus cerebralis conlleva a pérdidas económicas ya sea por muerte, como por el deterioro físico y disminución de la producción en los animales afectados(Scala y col., 2007; Shiferaw y Abdela, 2016).
La enfermedad es poco común en bovinos, sin embargo ha sido diagnosticada en Japón (Yoshino y Momotani, 1988), Irán (Moghaddar y col., 1992), Grecia (Giadinis y col., 2007), Brasil (Ferreira y col., 1992; Giaretta y col., 2013), Turquía (Avcioglu y col., 2012; Özkany col., 2011) e Italia (Varcasiay col., 2013). Particularmente en Uruguay, la presencia del parásito se ha constatado en varios departamentos (Cabrera y col., 1996; Oku y col., 2004) y han sido reportados varios casos de coenurosis en ovinos (Buroni, 2014; Dutra, 2011a ; Matto y col., 2014). A la fecha se ha reportado un único caso en bovinos en Uruguay en el año 2011, en el departamento de Cerro Largo (Dutra, 2011b).
El objetivo del presente trabajo fue describir un foco deinfección por Coenurus cerebralis en bovinos en Uruguay,diagnosticado mediante las lesiones macroscópicase histológicasy por técnicas moleculares (PCR/secuenciación).
Materiales y Métodos:
Datos epidemiológicos y clínicos:
En abril de 2016 el Laboratorio Regional Noroeste de la División de Laboratorios Veterinarios “Miguel C. Rubino” fue consultado debido a que dos vaquillonas presentaban un prolongado deterioro del estado general de salud, acompañado por síntomas nerviosos.
La enfermedad se presentó en un establecimiento ganadero del departamento de Paysandú (Uruguay, 32º03´55.1”S, 57º00´48.8”W) con pastoreo mixto de ovinos, bovinos y equinos. El establecimiento contabacon una dotación de 5 caninos, los mismos erandesparasitados habitualmente con Praziquantel cada dos meses. Durante la realización de un breve cuestionario, el personal del establecimiento expresó que se realizan faenas domiciliarias únicamente de lanares y que los desechos de las mismas no son arrojados a los caninos, sino que sondescartados e incinerados. Por otro lado, informaron que no han detectado perros sin propietario en la zona, pero si han observado gran cantidad de zorros.
En la visita al predio se constató la presencia de un animal con 48 h de muerto al cual el personal de campole extrajoy refrigeró la cabeza, la extracciónfue realizada por incisión a nivel de la articulación atlantooccipital (Caso A); Otro animal vivo con sintomatología nerviosa fue sacrificado por exsanguinación aguda previa sedación con Xilased 10®(0,35 mg/kg i/m de hidro clo ruro de xilazina, Vetcross, Montevideo, Uruguay) al que se le practicó su necropsiainmediatamente (Caso B).
Durante la extracción del encéfalo del Caso A se visualizó una vesícula quística en el hemisferio izquierdo que se rompió espontáneamente (Figura I).
Figura I: Caso A, vaquillona de 2-3 años. Se observa una vesícula quística (flecha) en hemisferio cerebral izquierdo.
En el Caso B protruía del hemisferio derecho una vesícula quística completa, la misma fue refrigerada para su posterior identificación (Figura II).
Histopatología:
Elencéfalo del Caso A, así comomuestras de órganos y sistema nervioso del Caso B fueron fijados en formol bufferado al 10 %.Posterior a la fijación se realizó el examen macroscópico del material tomando muestras para ser incluidas en parafina, seccionadas a 3 µmy coloreadas por la técnica de rutina, hematoxilina-eosina (H-E)(AFIP, 1995).
Análisis morfológico:
Se llevó a cabo el análisis morfológico de la vesícula quística del Caso Btomando en cuenta varios criterios: tamaño, peso y apariencia macroscópica. En la lupa estereoscópicase realizó el conteo total de escólices. Al microscopio, con una magnificación de 4x,se buscó la presencia de las estructuras características del metacestode (corona de ganchos y ventosas) (Rostami y col., 2013).
Extracción de ADN y PCR:
Se extrajo un trozo de membrana que contenía aproximadamente 30-50 escólices y se colocó en un tubo eppendorf de 1,5ml. La extracción de ADN se realizó siguiendolas instrucciones del kit comercial PureLinkTM Genomic DNA (Invitrogen, Alemania). Para la caracterización molecular se amplificóun fragmento del gen mitocondrial de la subunidad 1 de la enzima NADH deshidrogenasa (nad1) siguiendo el protocolo descrito por Armua-Fernandez y col., (2011). Se incluyeron en la reacción de PCR un control positivo (ADN de C. cerebralis de origen ovino) y un control negativo (agua destilada). Los amplicones obtenidos fueron visualizados bajo luz ultravioleta inmediatamente seguido de una corrida electroforética en un gel de 1,5% de agarosa conteniendo 1:2.5x10-4 GoodViewTM (SBS Gentech, China).Los productos de PCR fueron purificados por medio del kit comercial PureLinkTM Quick PCR purification (Invitrogen, Alemania) y enviados a secuenciar a Macrogen DNA Sequencing Service (Corea del Sur). Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las disponibles en el Genbank por medio de la herramienta BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Resultados:
Datos epidemiológicos y clínicos:
Ambos casos ocurrieron en un lote de 212 vaquillonas Hereford, de 2 a 3 años de edad, pastoreando campo natural en costas del Río Queguay.
El personal del establecimiento relató que la vaquillona del Caso A comenzó con los síntomas en el mes de marzo, notando un severo desmejoramiento en 10 días presentandoataxia, torneo y desviación de la cabeza.
El Caso B comenzó con los síntomas en el mes de febrero, con una evolución de 60 días al momento del sacrificio.Durante la revisación clínica se constataron las mismas alteraciones descriptas para el Caso A junto con pérdida parcial de la visión.
Patología macroscópica:
En el hemisferio cerebral izquierdo del caso A se constató la presencia de una cavidad de 6,8 x 7,0 x 6,7 cm desde frontal a parietal que estuvo ocupada por una vesícula;en el interior de la misma se visualizó la membrana de envoltura de la vesículaquística, de aspecto liso y transparente.En el hemisferio derecho,la porción rostral del ventrículo lateral estaba comprimida por la presencia de la vesícula, formando una cavidad en cuña hacia craneal cuyo extremo se encontraba entre el lóbulo occipital y parietal del cerebro.
Transversalmente, la vesícula llegaba hasta el ventrículo lateral derecho a través del tercer ventrículo sin invadirlo ni deformarlo. Sin embargo, sobre el lado izquierdollegaba a la parte craneal del lóbulo parietal y borde anterior del lóbulo temporal.
En el Caso B, se observóasimetría entre ambos hemisferios cerebrales, siendo el derecho de mayor tamaño y menor consistencia que el izquierdo.A nivel del lóbulo frontal del hemisferio derecho se notó una zona de la corteza cerebral más delgada de lo habitual.La cavidad que contenía la vesícula quística medía 10 x 10,2 x 9,9 cm, ocupando las tres cuartes partes rostrales del hemisferio cerebral derecho, dilatando el ventrículo lateral.Se observó un adelgazamiento de la sustancia gris y blanca subcortical a nivel del lóbulo frontal y parietal, más marcado hacia medial. La membrana de envoltura de la vesícula quísticapresentaba una zonaexterna lisa, fina, casi transparente y una interna de mayor espesor, de superficie rugosa y color amarronado en forma de anillo que envolvía el área de menor espesor de la corteza. La cavidad quística provocó una dilatación tanto del tercer ventrículo como del cuarto, generando una amplia comunicación entre ambos de 45 mm x 2mm. No se observó ninguna lesión macroscópica en el resto de los órganos internos.
Histopatología:
En ambos casos se observaron lesiones en el sistema nervioso central adyacente a la ubicación de la vesícula quística. El Caso A presentódegeneración neuronal, satelitosis, edema perineuronal,vacuolización difusa de la sustancia blanca, microgliosis difusa moderada a severa, edema perivascular ymanguitos perivasculares asociado a infiltración meníngea de tipo linfoplasmocitario con escasos polimorfonucleares.
En el Caso B, las meninges se encontraban congestivas e infiltradas por elementos mononucleares. Enel hemisferio cerebral izquierdo se apreció vacuolización de la sustancia blanca, microgliosis difusa, satelitosis, neuronofagia, moderada necrosis cortical laminar con congestión y edema perivascular difuso.
A nivel del hemisferio cerebral derecho, se constató atrofia cortical debido a la compresión causada por la presencia del quiste, con alteración total de su arquitectura normal, severa vacuolización, degeneración y necrosis neuronal difusa moderada a severa, con satelitosis, microgliosis difusa y manguitos perivasculares. Adyacente a la pared del quiste se observó una densareacción inflamatoriaconstituidapor infiltración de linfocitos, macrófagos, eosinófilos, células gigantes e hiperemia (Figura III).
Análisis morfológico de la vesícula quística:
Morfológicamente, la larva tenía una forma redondeada de 12cm de diámetro con contendido acuoso transparente en su interior (Figura IVa). Exteriormente la delimitaba una membrana translúcida que dejaba ver en su interior acúmulos de escólices de color blanquecino adheridos a la misma. El peso neto de la larva fue de 143 g. Luego de la punción y vaciamiento, se procedió al conteo de escólices bajo la lupa estereoscópica. El número total de escólices fue de 830. En el microscopio con un aumento 10x se pudo visualizar en detalle en cada escólex una corona de ganchos y ventosas (Figura IVb, IVc).
PCR:
La banda visualizada en el gel de agarosa correspondió al tamaño esperado para la amplificación del fragmento del gen nad1 (474pb) (Figura V).
Figura V: Gel de electroforesis mostrando los amplicones obtenidos luego de la reacción de PCR utilizando primers nad1 (de aproximadamente 500 pares de bases). Carril 1: marcador de peso molecular; carril 2: membrana de vesícula quística de bovino caso B; carril 3: control negativo (agua destilada) y carril 4: control positivo (ADN de C. cerebralis de origen ovino).
Se obtuvieron dos secuencias a partir de cada primer, luego del alineamiento de las mismas se generó una secuencia consenso la cual fue sometida a la búsqueda con la herramienta BLAST, la cual arrojó 99% de homología con secuencias registradas para Taenia multiceps (FJ495086).
Discusión:
La coenurosis en ovinos y otros pequeños rumiantes es un hallazgo frecuente en zonas endémicas de T. multiceps y su presencia ocasiona importantes pérdidas económicas, ya sea por muerte, como por el deterioro físico y disminución de la producción en los animales afectados (Scala y col., 2007). Sin embargo, la presentación de coenurosis en bovinos parece ser mucho más esporádica, ya que existen muy escasos reportes (Avcioglu y col., 2012; Ferreira y col., 1992; Giadinis y col., 2007; Giaretta y col., 2013; Moghaddar y col., 1992; Özkan y col., 2011; Varcasia y col., 2013; Yoshino y Momotani, 1988).
Epidemiológicamente, tanto cánidos domésticos como salvajes (perros, zorros, chacales y coyotes) están citados como hospederos definitivos de T. multiceps (Rostami y col., 2013). Los cánidos infectados defecan en el campo contaminando las pasturas en que los rumiantes se alimentan. Los mismos adquieren la infección por medio de predación o cuando son alimentados directamente con cráneos infectados durante las faenas domiciliarias. Hasta la fecha, la droga de elección para combatir las cestodosis en caninos es el Praziquantel (Giri y Roy, 2016). Esta droga si bien es altamente efectiva, tiene dos desventajas principales: no tener efecto residual y no ser ovicida. Por lo tanto, si un cánido que fue desparasitado consume nuevamente un encéfalo infectado, el ciclo se reanudará inmediatamente. Por otro lado, luego de una desparasitación, los estróbilos completos de T. multiceps son desintegrados en el intestino y los huevos (aún viables) son liberados al medio ambiente. En estudios realizados con Echinococcus multilocularis, otra tenia perteneciente a la misma familia, se constató que los huevos de dicho parásito pueden soportar un rango muy amplio de temperaturas y humedad pudiendo persistir infectantes por un largo periodo (Federer y col., 2015; Veit y col., 1995). Por consiguiente, la alta oferta de huevos en el ambiente y los hábitos alimenticios de los cánidos hacen que esta parasitosis se perpetúe.
En Uruguay, se han diagnosticado varios perros infectados con T. multiceps (Cabrera y col., 1996; Oku y col., 2004).Por el contrario, existe nula o muy poca información disponible con respecto a la fauna parasitaria de los cánidos salvajes que habitan nuestro territorio. Esta información parcial, ha llevado tradicionalmente a pensar que los perros son los únicos hospederos relevantes en el ciclo biológico de este parásito en Uruguay.Sin embargo, en el caso de este establecimiento, donde se practica la desparasitación periódica de los perros y se ha constatado la presencia de poblaciones de zorros, deja la interrogante si los mismos estuvieron o no implicados en la propagación de este parásito.
En este estudio, los quistes fueron encontrados en ambos casos en los hemisferios cerebrales, en lóbulos frontal, temporal y parietal en concordancia con lo reportado en la literatura (Avcioglu y col., 2012; Moghaddar y col., 1992; Yoshino y Momotani, 1987). En nuestro trabajo las lesiones histopatológicas fueron casi similares a las reportadas porAvcioglu y col. (2012) y Yoshino y Momotani (1988), exceptuando que no se observaron en ninguno de los dos casos depósitos de calcio.
Los genes mitocondriales, en especial nad1, han sido extensamente utilizados para la caracterización molecular de varias especies y cepas de cestodos (Armua-Fernandez y col., 2011; Lavikainen y col., 2008). Estos genes están presentes tanto en los metacestodos como en las formas adultas. En ambos casos presentados en este trabajo se obtuvo la confirmación mediante estudios morfológicos de que se trataba de C. cerebralis. Asimismo, en el Caso B, se pudo efectuar la confirmación molecular, revelando un 99% de identidad con T. multiceps.
Si bien el ciclo más común estaría dado por la interacción presa (oveja)/predador (perro), el rol epidemiológico de los bovinos como hospederos intermediarios de C. cerebralis se desconoce. La fertilidad de los quistes encontrados (presencia de escólices maduros) lleva a suponer que estos metacestodes eran viables y podrían haber sido una fuente de infección para los cánidos que se encuentran presentes en el establecimiento, aunque el acceso al cerebro bovino por parte de los cánidos no es tan frecuente como al de los ovinos.
En conclusión, el presente trabajo demuestra que la coenurosis, causada por C. cerebralis, se encuentra presente en bovinos en Uruguay. Consideramos pertinente la realización de futuros trabajos para estimar la prevalencia y el rol de los bovinos en la epidemiología de este parásito.
