Introducción:

La Influenza equina (o Gripe Equina)es una enfermedad respiratoria aguda que afecta a los caballos, burros, mulas y cebras y es causada por los subtipos H7N7 y H3N8 del virus del género Influenza A de la familia Orthomyxoviridae. El subtipo H7N7 no ha sido aislado desde más de 30 años y el subtipo H3N8 es considerado como el patógeno respiratorio más importante de los caballos debido a su naturaleza altamente contagiosa y a su rápida propagación entre animales susceptibles (^{Timoney, 1996}).

En équidos muy susceptibles, los síntomas clínicos incluyen fiebre, tos seca seguida de descarga nasal mucopurulenta debida a infección bacteriana secundaria (^{Cullinane y col.,2013}). En animales vacunados con inmunidad parcial, puede estar ausente uno o más de estos síntomas (^{Daly y col., 2004}).

La Gripe Equina se presenta en el continente americano en forma endémica (^{Bryant y col., 2009}). En el Uruguay,el primer diagnóstico de laboratorio se realizó en 1963 (^{Vallone y col., 1965}) a partir de entonces se presenta en forma periódica, ydesde el 2006se notifica anualmente a la Organización Mundial de Salud Animal(^{OIE, 2012}, ²⁰¹³, ^2014-2016).

El control y la prevención de la enfermedad dependen de la aplicación de planes de vacunación eficaces y prácticas de bioseguridad que reduzcan el riesgo de trasmisión a la población susceptible y disminuyan la producción de grandes cantidades de aerosoles (^{Van Maanen, 2002}).

Se ha demostrado en estudios epidemiológicos y experimentales, que el grado de protección inducido por la vacunación con vacunas inactivadas, está estrechamente relacionado con el nivel de anticuerpos circulantes contra la hemaglutinina(HA) del virus de Influenzamedidos por la técnica de Hemólisis Radial Simple (en inglés significa Single Radial Hemolisis y se abrevia:SRH), siendo el área de hemólisis producida por los anticuerpos contra la HAdel virus de Influenza, directamente proporcional al nivel de protección contra la infección viral(^{Morley y col.,1995},^{Townsend y col., 1999},^{Mumford, 2001},^{Wood y col., 2007}).La HA es la mayor proteína de la envoltura viral, tiene la propiedad de aglutinar eritrocitos, y se sintetiza como un único polipéptido que se desdobla en dos cadenas HA1 Y HA2 unidas por puentes disulfuro, durante la replicación viral. La misma se une a receptores que contienen ácido siálico a la membrana celular de la célula huésped. La HA es el principal blanco de la respuesta inmune protectiva y por lo tanto es el componente fundamental a considerar en la formulación de las vacunas (^{Lewis y col, 2011}).Los equinos que presentan valores menores a 50 mm² son susceptibles a la infección, mientras que los que tienenentre 50 y 85 mm²están parcialmente protegidos manifestando síntomas más leves y en un período más breve. Los que tienen área de hemólisis entre 85 y 140 mm²se encuentran clínicamente protegidos (protección clínica), y no manifiestan síntomas durante la infección viral, sin embargo, pueden eliminar virus infeccioso por aerosoles nasales (^{Mumford y col.,1994}, ^{Newton y col., 2000a} , ^{Mumford, 2001}). Los que tienen valores mayores a > 140-150 mm², están clínicamente y virológicamente protegidos (protección virológica), es decir no excretan virus durante la infección viral (^{Newton y col., 2000a} ). Los equinos que presentan niveles de anticuerpos menores a 50mm², tienen una probabilidad 15 veces mayor de ser casos índices ante la aparición de un brote de Gripe equina, lo cual representa un gran riesgo de infección para los equinos que están en contacto (^{Mumford, 2001}).

Si bien la inmunidad celular es un componente importante en la respuesta inmune a la infección por el virus de Influenza, la misma no jugaría un rol importante cuando se usan vacunas inactivadas (^{Newton y col., 2000a}). A su vez existen diversos factores de riesgo queafectan el nivel de anticuerpos contra la hemaglutinina, tales como la edad,sexo,el número total de vacunas administradas, tiempo transcurrido desde la última vacunación y edad del animal cuando se vacunó por primera vez (^{Newton y col., 2000}b, ^{Barquero y col., 2007}).

En nuestro país, la vacunación contra la Influenza equina es obligatoria para todos los equinos con actividad deportiva, debiéndose revacunar cada 3 a 4 meses. La vacuna autorizada en Uruguay debe ser inactivada y contiene los subtipos H7N7 y H3N8 del virus de Influenza equina, aunque también se usan vacunas monovalentes al subtipo H3N8. Debido a que ya hace más de dos décadas que no se registran casos de Influenza equina causados por el subtipo H7N7, la OIE considera que ya no es necesario incluir esta cepa en la vacuna, y recomienda el uso de cepas representativas de los clados 1 y 2 del sublinaje Florida del virus H3N8. Sin embargo, la detección de anticuerpos para este virus es de gran utilidad porque permite diferenciar anticuerpos asociados a infección de los inducidos por la vacunación (^{Gildea y col.,2010}).

En Uruguay, no se conoce el grado de nivel de protección de la población vacunada ni tampoco se sabe en qué medida están asociadosa factores tales como la edad, raza, sexo e historia de vacunación.

El objetivo del presente trabajo es determinar la susceptibilidadde equinos de deporteen Uruguay a la infección por el virus de influenza equina mediante la cuantificación de anticuerpos SRH, y estudiar su asociación con factores como la edad, raza, sexo, e historia de vacunación.

Materiales y métodos:

Resultados:

De un total de 1.532 sueros, se observaron que faltaban los datos con respecto a las siguientes variables: estatus de vacunación 67 (4%), razas 43 (3%), sexo 56 (4%) y edad 88 (6%). Es así que el registro está completo para 1.390equinos y no fueron considerados 142 (9%) por tener datos “missing” al menos en una de las variables.

De los registros considerados,321(23%) de las muestras corresponden a equinos vacunados contra Influenza Equina en un plazo menor a los 4 meses y mayor a los 15 días de la toma de muestra de sangre.

La distribución de la muestra por razas nos muestra que las 2 principales son las cruzas570 (41%) y SPC619 (45%). Con menor representación aparecen: criolla 98 (7%), árabe 67 (5%) y cuarto de milla 36 (3%).

La distribución por sexo es bastante uniforme entre los que tienen esa información: machos 545 (39%), hembras 504 (36%) y machos castrados 341 (25%).

En cuanto a las edades están distribuidos de la siguiente forma: menores o iguales a 2 años 345 (25%), 3 a 4 años 399 (29%), 5 a 9 años 548 (39%) y mayores o iguales a 10 años 96 (7%).

En el Cuadro 1 se observa la relación entre la respuesta a la prueba SRH frente alvirus H3N8 y la vacunación (Chi² _H3N8=29.47p <0.05).

Cuadro 1 Relación protección en vacunados y no vacunados frente a H3N8 

En el Cuadro 2 se muestran los resultados obtenidos en el análisis univariadodel riesgo de infección por virus H3N8 en relación a las variables: vacunación, edad, raza y sexo, Se comprueba,como es de esperar, mayor riesgo de infecciónfrente al H3N8en los animales no vacunados frente a los vacunados,27% vs 17% respectivamente(p <0.05).

Cuadro 2 Riesgode infección para H3N8 en relación a las variables vacuna, edad, raza y sexo. 

La raza criolla obtuvolamenor proporción de equinos con mayor riesgo(área de hemólisis < 50 mm²) a la infección por virus H3N8 (7%), mientras que la raza árabe presentó los mayores valores(31%) y los pura sangre tuvieron valores intermedios (26%). La raza estuvo asociada significativamente con la categoría de protección de estos virus (p<0,05).

Según se muestra enelCuadro2, la proporción de equinos susceptibles a infección por H3N8, es mayor enel grupo etariode 0 a 2años de edad(33%) que en los grupos mayores donde cae sistemática y significativamente con la edad (p<0,05).

En relación al sexo la proporción de equinos susceptibles a gripeequina es significativamentediferente entre ellos (p<0,05),mostrando que los machos castrados son los que tienen mayor riesgo.

El modelo de regresión logística para las variables de respuesta de menor riesgo (más de 50 mm² de SRH) de infección frente al virus H3N8(Cuadro3) muestran que los OR de las variablesestán asociados significativamente controlando por el efecto de confusión que podría ejercer alguna de las variables independientes sobre las otras.La vacunación disminuye el riesgo, así como el incremento de edades en forma consistente.La raza utilizada comoreferencia, fue la árabe y las otras razas con la excepción del cuarto de millas muestran menor riesgo, fundamentalmente la criolla. Las diferencia en sexo macho vs hembra no son significativos, pero los machos castrados significativamente presentan mayor riesgo.

Cuadro 3 Regresión logística protección (menor riesgo) para H3N8 en relación a las variables independientes de vacuna, edad, raza y sexo 

Discusión:

La Influenza equina es una enfermedad muy contagiosa y se considera que un equino infectado puede infectar a otros 10 equinos que están en contacto con él (^{Glass y col., 2002}). Por lo tanto la identificación de la población susceptible permite establecer planes de vacunación más eficaces que tengan como finalidad reducir el impacto de un brote con la consecuente interrupción de eventos ecuestres (^{Gildea y col., 2010}). Los equinos que presentan niveles de anticuerpos menores a 50 mm² representan a la población con mayor riesgo de infección (^{Mumford, 2001}).

La mayor proporción de muestras pertenecen a la raza Pura Sangre de Carrera encabezando el grupo más importante de las razas equinas que participan en actividades de deporte en el Uruguay, lo cual coincide con lo descrito por otros autores (^{Ferrari, 2012}).

Se pudo constatar una baja cobertura de vacunacióncontra influenza equina, ya que solo el 23% de la población estudiada presentaba registros de vacunación vigentes(lapso no mayor a los 4 meses ni menor a los 15 días).Se considera que la cobertura de vacunación debería alcanzar el 70% para evitar o controlar la aparición de un brote(^{Baker, 1986}), e incluso otros autores sostienen que para asegurar la inmunidad poblacional, la misma tendría que ser mayor al 83%-94% (^{Satou, 2006}).

Según lo establecido por diversos autores, se requieren valores de SRH entre 85-140 mm2 y mayores a 140 mm² para alcanzar los niveles de protección clínica y virológica respectivamente (^{Gildea y col., 2010}, ^{Mumford, 1992}, ^{Mumford y col., 1994}, ^{Mumford, 2001}). Solo el nivel de protección virológica evita la excreción del virus durante la infección viral, impidiendo el contagio y la infección a otros equinos y la expansión de un posible brote.En tal sentido, soloel 27 y el 35%de la población estudiada presenta un nivel de protección clínica y virológica respectivamente,frente a la infección por el virus H3N8. La inmunidad parcial solo lograría evitar la aparición o atenuar los síntomas clínicos, pero no evitaría la excreción viral exponiendo al resto de la población susceptible a la infección viral. Esto representa un riesgo importante para la introducción y/o expansión de la enfermedad, ya que podrían ingresar equinos clínicamente sanos, pero portadores del virus infeccioso con la amenaza potencial de infectar a equinos susceptibles. Por ejemplo, el brote ocurrido en Australia en el 2007, que causó pérdidas de aproximadamente un billón de dólares para la industria equina, se debió a la importación de equinos vacunados con infección subclínica por virus H3N8 tipo Florida clado 1(^{Gildea y col., 2010}). Dichos equinos fueron importados de Japón donde fueron vacunados con vacunas elaboradas con cepas de virus no actualizadas y por lo tanto las mismas no conferían niveles de protección suficientes para proteger frente a la infección inducida por las cepas de virus de campo actuante en el momento del brote (^{Paillot, 2014}).

En otro estudio realizado en Argentina (^{Carosino y col., 2014}) se comprobó que un 97% y 74% de la población de equinos del hipódromo de Palermo, y un 88.5% y 89% de la de San Isidro presentaban niveles de anticuerpos altos e intermedios en 2012 y 2013 respectivamente,concluyendo queel riesgo de padecer un brote epizoótico de Influenza equina tras una re-introducción del virus en estas poblaciones era bajo, a pesarque en el hipódromo de Palermo se observó un incremento en el número de equinos con bajos niveles de anticuerpos en el muestreo de 2013, lo que por consiguiente aumentaría el riesgo de infección en dicha población

Solo el 63% de los equinos menores de 2 años presentan niveles de anticuerpos para el virus H3N8 mayores a 50 mm² que se asocian a una población con menor riesgo de infección frente a este virus. El valor promedio del área para esta categoría de edad fue de 77mm² que es un valor intermedio y similar a los hallados en Reino Unido por ^{Newton y col., (2000}a), valores promedio de 64 mm² y 115 mm² para equinos de 1 y 2 años respectivamente. A su vez, en Irlanda(^{Gildea y col., 2010}), los valores promedio hallados, fueron de 94 mm², para equinos de un año de edad. Estos hallazgos estarían indicando que el nivel de protección frente a la infección de virus H3N8 sería un poco más bajo que el encontrado en estos países y quizás tendríamos que diferenciar entre los valores de 1 y 2 años lo cual no es posible comprobar con los datos disponibles.

Al igual que lo descrito por otros autores (^{Newton y col.,2000}b, ^{Gildea y col., 2010}) en este estudio se encontró que la proporción de equinos susceptibles a infección por H3N8, es mayor enel grupo etariode 0 a 2años de edadque en los grupos mayores donde cae sistemática y significativamente con la edad (p<0,05). Esta asociación entre la edad y la susceptibilidad es confirmada por el modelo de regresión logística, el cual al ajustar por raza, sexo y estatus de vacunación demuestra que no se trata la misma de un efecto de confusión por las otras variables.

Esto determina que los equinos más jóvenes, seanmás susceptibles a la infección viral, en especial los que están alojados en ambientes poco ventilados, con gran concentración de animales, como por ejemplo lo son los lugares de venta, o de entrenamiento (^{Newton y col., 2000}b).

La falla de la inmunidadestaría vinculada a la baja cobertura de vacunación,baja potencia de las vacunas, pobre respuesta inmune y diferencias antigénicas entre el virus vaccinal y de campo (^{Newton y col.,2000}a y ^2000b, ^{Gildea, y col., 2011}).

Según los resultados del análisis de regresión logística, todas las variables estudiadas están asociadas significativamente. El análisis estadístico de regresión logística permite ponderar la variable en estudio (nivel de anticuerpos SRH) con los diferentes factores de asociación (vacunación, edad, raza, sexo) estableciendo asociaciones entre ellos significativas.La raza criollaobtuvo mayor nivel de protección virológica que las otras razas, y los factores comola vacunación vigente y el aumento de la edad disminuyen el riesgo de infección por el virus H3N8. Una causa probable de que la raza criolla haya presentado niveles de protección virológica mayores que las otras razas puede ser que la misma haya sido sometida a planes más rigurosos de vacunación contra Influenza Equina. Sin embargo es muy difícil tener información confiable acerca de los antecedentes de vacunaciones y revacunaciones correspondientes. Considerando que el efecto de la raza en el modelo está controlado por la edad, sexo y estatus de vacunaciónes posible que la misma se pueda explicar por factores genéticos, pero para demostrarlo sería necesario confirmarlo con otros estudios.

En relación al sexo, no se halló una diferencia significativa entre los grupos macho y hembra, pero los machos castrados presentan mayor riesgo a la infección una vez controlado los efectos de la raza, edad y estatus de vacunación.No se pudo comparar nuestros resultados con los hallados por otros autores debido a que se clasificaron los sexos en forma diferente. En este estudio se definieron tres grupos, machos, machos castrados y hembras. Al no estar incluida la categoría macho castrado en lo reportado por otros autores, es difícil hacer comparaciones con los hallazgos obtenidos. Si se consideraran a los machos castrados como machos, entonces en el análisis estadístico no se encontrarían diferencias significativas entre las categorías hembra y macho.Otros autores han encontrado que el sexo macho está asociado a un mayor riesgo frente a la infección del virus H3N8.Por ejemplo, ^{Barquero y col. (2007}) sostienen que existe dismorfismo sexual, siendo los machos más susceptibles a la infección debido a mecanismos inhibitorios de la testosterona en la respuesta inmune.Por otro lado ^{Ryan y col.(2015}), encontraron diferencias significativas en los niveles de anticuerpos SRH entre machos y hembras un mes post revacunación. Las hembras presentaban una respuesta superior, posiblemente debida a unamayor producción de linfocitos CD4+ inducida por la revacunación contra la Influenza equina. Sin embargo, estos autores también incluyen a los machos castrados, en la categoría de los machos.Por lo tanto sería necesario realizar otros estudios que confirmen estos hallazgos utilizando categorías de sexo bien definidas.

Conclusiones:

Se observó una baja cobertura de vacunación contra la Gripe Equina en los equinos de deporte. Además se comprobó un nivel muy bajo de protección clínica y virológica frente a la infección de virus H3N8 determinado por la prueba SRH. El nivel de protección contra el virus de Influenza equinaH3N8 está asociado a factores como la raza, edad, sexo y la vacunación. El análisis estadístico de regresión logística permite inferir una mayor susceptibilidad a la infección por el virus H3N8, en equinos que no tienen vacunación vigente, en la raza árabe y cuarto de milla, en los equinos menores a 2 años de edady en los machos castrados.Sería importante confirmar estas asociaciones con otros estudiosy poblaciones que puedan confirmarlas o desecharlas.

Porotro lado se debería fortalecer la vigilancia epidemiológica y los programas de vacunación especialmente en las poblaciones con mayor riesgo de infección, a los efectos de prevenir y reducir el impacto económico-social de nuevos brotes epidémicos de Influenza equina.

A tales efectos, la prueba de SRH podría ser una herramientaútil para monitorear el nivel de inmunidad de la población equina, y para establecer programas de vacunación, en base a evidencias científicas, más eficaces.