Introducción

El virus de la Leucosis Bovina Enzoótica es el principal patógeno viral que afecta la lechería en muchos países del mundo. En Uruguay las prevalencias son muy altas, mayores al 70% en rodeos de leche (^{Furtado et al., 2013}), incluso en animales jóvenes hemos reportado previamente prevalencias mayores al 50% ^{(Puentes et al. 2016 a)}. El virus afecta células de la línea linfoide, principalmente los linfocitos B CD5+ que expresan inmunoglobulina M en su superficie, además de monocitos y macrófagos (^{OIE, 2012}). El 90% de los animales infectados son asintomáticos, produciendo pérdidas productivas asociadas principalmente a la dificultad de exportación de animales en pie, disminución de la producción láctea como también la longevidad del animal y desregulación a nivel inmunológico (^{Erskine et al., 2011}; ^{Souza et al., 2012}; ^{Bartlett et al., 2013}, ^{Della Libera et al., 2015}; ^{Frie et al., 2016}, ^{Puentes et al., 2016b}; ^{Frie et al., 2017}).

Se ha demostrado que la infección subclínica por este virus causa disfunciones importantes del sistema inmune que impactan directamente en la sanidad (^{Bartlett et al., 2014}), como por ejemplo disminución de la función de los polimorfonucleares in vitro inducido por Escherichia coli (E. coli) en vacas infectadas (^{Souza et al., 2012}). El BLV no sólo causa inmunodepresión sino que además genera disturbios inmunológicos a nivel de la inmunidad celular, modificando el perfil de las células T (^{Frie y Coussens, 2015}), que son claves en la regulación del sistema inmune tanto en infecciones naturales como en la respuesta a inmunizaciones por vacunación. Las células T infectadas con el virus, expresan mayor cantidad de receptores inmunoinhibitorios, lo que aumenta la habilidad de los patógenos que causan infecciones crónicas a evadir la respuesta inmune del hospedador, aumentando por ejemplo la expresión de IL-10 o disminuyendo la de IL2, IL12 e IFN-γ (^{Konnai et al., 2003}; ^{Amills et al., 2004}). Estas alteraciones del sistema inmune, destacados con mayor magnitud en animales con linfocitosis persistente podrían tener un impacto negativo en la capacidad de ganado para resistir al avance de la enfermedad infecciosa o a la respuesta a vacunas; en este mismo sentido algunos estudios reportaron una correlación positiva entre BLV y otras enfermedades (^{Emanuelson et al., 1992}; ^{Trainin et al., 1996}) o cuestionan la habilidad de bovinos infectados con BLV para responder inmunológicamente contra otros patógenos (^{Erskine et al., 2011}; ^{Puentes et al., 2016}b; ^{Frie et al., 2016}; ^{Frie et al., 2017}).

Las enfermedades clostridiales constituyen una amenaza constante en la cría de ganado bovino, causando diversas afecciones como “mancha”, “gangrena gaseosa”, enterotoxemias, hemoglobinuria bacilar, hepatitis necrótica, tétanos y botulismo. En cuanto al Clostridium perfringens, bacteria anaeróbica, los más importantes en medicina veterinaria son el tipo C y el D. El tipo C produce toxinas alfa y beta y el D produce las toxinas alfa y épsilon. Estas tres toxinas son las más importantes en la patogénesis de las enterotoxemias de etiología clostridial en animales de producción (^{Moreira et al., 2016}).

La evaluación de la potencia en vacunas clostridiales que contienen toxoides de C. perfringens se basa en la cuantificación de anticuerpos específicos desarrollados posvacunación en conejos empleando la prueba de neutralización in vivo en ratones, el ensayo de ELISA o el test de seroneutralización in vitro en cultivos celulares. Ensayos comerciales para evaluar la respuesta serológica frente a las toxinas letales no están disponibles fácilmente para el diagnóstico en laboratorios (^{Simpson et al., 2018}). En este sentido, se ha desarrollado la técnica de SN in vitro empleando la línea celular de riñón canino (MDCK) para evaluar anticuerpos anti toxinas épsilon que puede ser empleada para controlar la potencia de las vacunas clostridiales (^{Salvarani et al., 2013}).

La prevención de enfermedades infecciosas en los rodeos lecheros es un componente crítico de la producción y el mantenimiento del bienestar animal, siendo las vacunas de gran utilidad para prevenir enfermedades. Desde el punto de vista práctico, la probabilidad de vacunar animales que estén infectados con BLV es muy alta en Uruguay, donde la seroprevalencia puede llegar a más del 70% en algunas zonas (^{Furtado et al., 2013}). Existen diversos cuestionamientos a nivel veterinario sobre la eficacia de las vacunas clostridiales comercializadas (^{Nascimento et al., 2004}; ^{Miranda et al., 2008}; ^{Salvarani et al., 2010}). Sin embargo, el foco de atención ha estado centrado sobre todo en la composición y fabricación de las vacunas y no tanto a las posibles fallas inmunológicas por infecciones virales crónicas que cursan con inmunodepresión como es el caso de BLV. Dada la importancia de la vacunación en la producción lechera y la evidente desregulación del sistema inmune en animales asintomáticos infectados con BLV, el objetivo de este estudio fue evaluar si la respuesta inmune humoral de vaquillonas holando serológicamente positivas al virus de la leucosis bovina (BLV) es afectada frente a la inmunización a campo con una vacuna clostridial. Este trabajo pretende por lo tanto aportar información referente a una problemática común que experimentan los veterinarios cuando implementan planes sanitarios para el ganado bovino.

Materiales y Métodos

Detección de anticuerpos anti-toxina alfa, beta y épsilon de Clostridium perfringens mediante ELISA

Para cuantificar anticuerpos específicos contra las toxinas alfa, beta y épsilon de C. perfringens, se utilizaron kits comerciales de ELISA de bloqueo BIO K 222/2 (toxina alfa) - BIO K 317/2 (toxina beta) y BIO K 291/2 (toxina épsilon) (Bio-X Diagnostics, Rochefort, Bélgica). Las muestras se procesaron individuales de acuerdo a las indicaciones del fabricante y la lectura de la densidad óptica (D.O) se realizó a 450 nm en un espectrofotómetro de rango visible (Thermo Fisher Scientific Inc., USA).

El cálculo para la cuantificación de los anticuerpos se realizó mediante el porcentaje de inhibición (% inh) para cada toxina según la siguiente fórmula: (D.O negativos - D.O positivos) / D.O negativos*100. El grado de positividad especificado por fabricante se observada en la Tabla 1.

Tabla 1: Grado de positividad según el porcentaje de inhibición a las toxinas del Clostridium perfringens según las indicaciones del fabricante de ELISA de bloqueo (Bio-X Diagnostics, Rochefort, Bélgica). 

Resultados

Anticuerpos anti-BLV durante el estudio

Los grupos BLV+ y BLV- permanecieron seropositivos y seronegativos respectivamente durante todo el experimento (Figura 1). Los animales culminaron el estudio con un peso promedio de 331±19 Kg y no manifestaron signos de enfermedad durante todo el estudio.

Figura 1: Cinética de los títulos de anticuerpos contra BLV mediante ELISA en los distintos grupos de animales a lo largo del ensayo de Clostridios. Para cada media se muestra el error estándar. El grupo BLV + (29), cuadrado gris y BLV - (19), círculo negro, permanecieron positivos y negativos durante todo el ensayo respectivamente. 

Respuesta a los diferentes antígenos según status a BLV

El porcentaje de inhibición anti-toxina generado luego de las inmunizaciones contra Clostridium perfringens en bovinos serológicamente positivos a BLV no difirió significativamente del porcentaje de inhibición de bovinos seronegativos para las tres toxinas en todo el estudio (p>0.05) (Figura 2).

Figura 2: Porcentaje de Inhibición anti Clostridium perfringens, determiando por ELISA de bloqueo. 2a. Toxina Alfa del Clostridium perfrigens. 2b. Toxina Beta del Clostridium perfringens. 2c Toxina Épsilon del Clostridium perfringens. Circulo negro grupo seronegativo, cuadrado gris animales seropositivos. Barra desvío de la media. No hubo diferencias significativas entre grupos seronegativo y seropositivos al virus de la Leucosis bovina (BLV) p>0.05. 

Al inicio del experimento (día 0), todos los bovinos presentaron niveles bajos de anticuerpos contras las tres toxinas del Clostridium perfringens (alfa, beta y épsilon) que se interpretaron como “niveles 0” de positividad según el kit de ELISA utilizado.

Se observó diferente cinética en la curva de anticuerpos entre las tres toxinas analizadas, pero entre grupos (BLV+ y BLV-) fue similar para los tres casos (Figura. 2a, b, c), al igual que la duración de la inmunidad, que no difirió según el status para BLV. Para la toxina épsilon se observó un descenso del título de anticuerpos aproximadamente a los 90 días, mostrando posteriormente un leve aumento de anticuerpos luego que los animales fueron revacunados a los 173 días (Figura. 2c). En el grupo BLV - el porcentaje de inhibición contra esta toxina fue mayor (nivel de positividad ++) que el grupo BLV + (nivel de positividad +) (Cuadro 1). Sin embargo esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p>0.05). No se observó dicho comportamiento para la toxina alfa, en la cual el título de anticuerpos aumentó a lo largo de todo el estudio (Figura. 2a).

En cuanto a la respuesta humoral contra la toxina beta, se observó una menor respuesta comparada con los resultados de las toxinas épsilon y alfa. La toxina beta para el grupo BLV+ obtuvo un porcentaje de inhibición por debajo del 20% correspondiente a un grado de positividad de 0 (Figura. 2b), mientras que en el grupo BLV- se observó un nivel de positividad + sólo el día 60 posvacunación.

Anticuerpos neutralizantes anti-toxina épsilon del Clostridium perfringens

Se observó un bajo título de anticuerpos neutralizantes tanto para el grupo BLV+ como el BLV- durante todo el ensayo. Al día 0 no se detectaron anticuerpos neutralizantes y luego de la primo-vacunación a los 30 días se observaron bajos títulos anticuerpos neutralizantes que fueron aumentando a los 60 días luego de la inmunización, siendo en este punto la obtención del mayor título. Esta diferencia fue mayor en los animales seropositivos a BLV, pero no fue significativa (p>0.05). A los 90 días del ensayo ya no se detectaron anticuerpos neutralizantes contra la toxina en ninguno de los dos grupos hasta el final del experimento (Figura 3).

Figura 3: Anticuerpos neutralizantes anti toxina épsilon del Clostridium perfringens determinado por seroneutralización in vitro. Se muestra la media de los pools para cada momento evaluado. Línea gris clara grupo seropositivo, línea negra grupo seronegativo. 

Discusión

Las pérdidas ocasionadas a los productores en Uruguay por muertes súbitas que muchas veces no llegan a diagnóstico definitivo, principalmente afectando categorías jóvenes, implican sistemáticamente un plan de vacunación estratégico que permitan lograr protección contra las principales enfermedades infecciosas asociadas a estos cuadros clínicos. En este sentido las vacunas clostridiales son un componente fundamental en los esquemas de sanidad del ganado ya que constituyen el principal mecanismo para controlar dichas enfermedades (^{Borrmann et al., 2006}; ^{Moreira et al., 2016}).

Teniendo en cuenta la alta seroprevalencia de BLV en rodeo del Uruguay y considerando el impacto que el mismo produce en el sistema inmune, se evaluó la posible interferencia entre la infección viral y la respuesta a la vacunación contra una de las principales vacunas utilizadas en la región.

Se utilizó la técnica de ELISA para determinar el status frente a la Leucosis Bovina debido a que la detección de anticuerpos específicos contra las proteínas virales gp51 y p24 en suero bovino, por ELISA, constituye el procedimiento de rutina más utilizado para la identificación de animales infectados asintomáticos (^{Trono et al., 2001}; ^{Gutiérrez et al., 2009}; ^{Erskine et al., 2011}). Los anticuerpos séricos contra las proteínas estructurales del virus persisten durante toda la vida del animal, si bien se han reportado descensos de anticuerpos en vacas preparto no detectables por esta técnica (^{Rama et al., 2010}). Sin embargo, el presente estudio se realizó en terneras durante un año resultando que todos los animales de los grupos permanecieron con la misma condición serológica y las mismas obtuvieron una ganancia de peso promedio de 500 gramos por día, esperable en las condiciones de crianza de este campo de recría. En base a estos resultados se entiende que los factores nutricionales que pueden afectar el desarrollo de la respuesta inmune pos-vacunación, incidieron en todos los bovinos del ensayo por igual y probablemente no hayan tenido efecto negativo sobre la respuesta evaluada.

No se encontraron diferencias en la respuesta inmune de anticuerpos totales inducida por la vacuna contra Clostridium perfringens entre animales seropositivos y seronegativos a BLV a nivel de campo. Trabajos reportados por ^{Erskine et al. (2011}) encontraron que la inmunización con una vacuna comercial conteniendo Escherichia coli, produjo un título significativamente menor de IgG2 en animales infectados con BLV. Asimismo, en un estudio reciente llevado a cabo por nuestro grupo de investigación, con animales seropositivos a BLV, se reportó un menor título de IgM e IgG1 cuando los animales fueron inmunizados contra el virus de Fiebre aftosa, pero esta diferencia no fue significativa cuando se compararon el nivel de anticuerpos totales (^{Puentes et al., 2016}b). En otros estudios han reportado menor producción de IgM en animales inmunizados a campo contra vacunas para Lesptospiras y herpesvirus tipo 1 y a su vez para este último también menor título de IgG2 (^{Frie et al., 2016}) Estos antecedentes pueden explicar el hecho de que en el presente ensayo no se hayan encontrado diferencias significativas, habiendo analizado anticuerpos totales contra las toxinas clostridiales y no discriminada por isotipos (IgM, IgG1 o IgG2) como lo hicieron los trabajos citados anteriormente. Se ha demostrado desde hace mucho tiempo que IgG1 e IgG2 bovinas promueven la opsonización y fagocitosis por macrófagos, y que solo IgG2 promueve la opsonización vía neutrófilos in vitro (^{Howard, 1984}). También los isotipos IgM, IgG1 e IgG2 están asociados a funciones neutralizantes dependiendo del agente infeccioso (^{Lin et al., 2001}; ^{Pega et al., 2013}). En este mismo sentido, las variaciones encontradas en estos datos pueden deberse a las diferencias entre los agentes evaluados en los estudios mencionados (virus ARNss desnudo, virus ADNds envueltos, y bacterias gram negativas y antígenos purificados), siendo el agente infeccioso de este estudio una bacteria gram positiva que induce la inmunidad fundamentalmente por medio de exotoxinas. Por lo tanto se podría esperar que las respuestas inmunes protectoras inducidas en cada caso sean diferentes en cuanto a isotipos de inmunoglobulinas. Trabajos recientes sugieren que los niveles de anticuerpos circulantes no explican completamente la protección generada por las vacunas anticlostridiales (^{Rossi et al., 2018}). Bajo las condiciones de este estudio y con las técnicas diagnósticas disponibles, no se pudo demostrar que las vaquillonas seropositivas (BLV+) presentaran una respuesta inmune diferente al rodeo de animales seronegativos (BLV-) después de la vacunación con toxoides de Clostridium perfringens. En futuros ensayos se deberán discriminar los isotipos de inmunoglobulinas u otros componentes del sistema inmune (ejemplo citoquinas), para determinar si existen diferencias a otro nivel que no fueron detectadas en la presente investigación.

Los animales vacunados respondieron exhibiendo un título de anticuerpos contra las toxinas alfa y épsilon luego de las dos primeras inmunizaciones con la vacuna comercial polivalente utilizada. Sin embargo la respuesta generada durante todo el estudio para la toxina beta corresponde a grados de positividad “0” que podría indicar una baja inmunogenicidad para esta toxina. De acuerdo a los resultados encontrados utilizando la técnica de SN in vitro, técnica de referencia (^{Salvarani et al., 2010}; ^{Souza et al., 2010}; ^{Salvarani et al., 2013}), todos los animales del estudio presentaron un bajo nivel de anticuerpos neutralizantes para la toxina épsilon luego de los 60 días post inmunización. Otros trabajos han encontrado disminución de los anticuerpos anti C. chauvoei luego de los 90 dpv en bovinos medidos por ELISA (^{Rivera Patrón, 2014}), así como un marcado descenso de los anticuerpos 90 dpv para nueve especies de clostridios diferentes luego de la inmunización de corderos (^{Rossi et al., 2018}). Por otro lado, y contradictorio a las demás toxinas, la respuesta de anticuerpos totales contra la toxina alfa en el presente ensayo fue aumentando a lo largo del tiempo hasta la finalización del experimento.

En cuanto a la duración de la inmunidad a lo largo del estudio de manera global, si bien la curva de respuesta fue diferente para las tres toxinas, se observa una disminución del título de anticuerpos anti toxina épsilon tanto por ELISA como por SN in vitro, luego de los 60 días. En este sentido, es importante destacar que la mayoría de las vacunas comerciales contra clostridios, recomiendan su revacunación anual.

En particular, se observaron algunos animales que al inicio del experimento presentaban bajos títulos de anticuerpos, principalmente contra la toxina alfa. Esto permite suponer, al no tener un grupo control de animales no inmunizados contra C. perfringens, que los animales estuvieron expuestos a la toxina de manera natural previo al ensayo. Esto se puede explicar por el hecho de que el género Clostridium está ampliamente distribuido en la naturaleza, principalmente en el suelo y en el tracto intestinal de los animales. Según otros autores (^{Matches et al., 1974}), es considerada la bacteria patógena más distribuida en el mundo, siendo el C. perfringens una de las especies más comunes en bovinos en nuestro país capaz de perdurar en el suelo durante años (^{Algorta y Cabrera, 2015}; ^{Banchero et al., 2016}).

En cuanto a la técnica ELISA de bloqueo utilizada para la determinación de la respuesta de anticuerpos totales en este ensayo, la misma está avalada por algunos autores que reportan la viabilidad de utilizarla para evaluar la respuesta serológica contra clostridios como alternativa a los ensayos biológicos (^{Krt, 1999}). Sin embargo, no existen suficientes evidencias que asocien los títulos de anticuerpos mediante ELISA y la protección in vivo contra la enfermedad. Un estudio reciente de ^{Goossens et al.., (2016}) encontraron altos títulos de anticuerpos anti-toxina alfa del C. perfringens, seis semanas luego de la vacunación, mediante ELISA (Bio-X Diagnostics) y los mismos inhibieron la actividad de la toxina alfa in vitro. Sin embargo no confirieron protección a la necrosis en el desafío a nivel intestinal en terneros. Existiendo por lo tanto una discrepancia entre los títulos de anticuerpos anti toxina alfa cuantificados por ELISA y la capacidad protectora de estos anticuerpos en el modelo de necrosis intestinal. Otro estudio similar, evidenció una muy buena correlación (0.5-0.8) entre un ensayo de ELISA desarrollado para detectar anticuerpos anti toxinas del C. perfringens y la seroneutralización (^{Borrmann et al., 2006}). Tanto los resultados de ELISA como los de SN in vitro en el presente estudio encuentran bajos títulos de anticuerpos. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este ensayo deben ser profundizados y comparados con pruebas de desafío a campo, con el fin de establecer si los títulos de anticuerpos pueden asociarse con la protección contra estas enfermedades.

Conclusiones

Este es el primer ensayo a campo en Uruguay que evaluó la respuesta humoral posvacunación para una vacuna policlostridial en bovinos y lo relacionó con la infección subclínica con el BLV. En cuanto a la infección con BLV, con las técnicas serológicas empleadas no se encontraron en el presente estudio diferencias significativas en la respuesta humoral contra toxoides de C. perfringens entre animales seronegativos y seropositivos a BLV.

La inmunización contra Clostridium perfringens en vaquillonas Holando presentó una pobre respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la toxina épsilon. La producción de anticuerpos totales cuantificados mediante ELISA comercial, difirió entre las tres toxinas evaluadas, encontrándose sólo para la toxina alfa una respuesta de anticuerpos que se mantuvo elevada a lo largo del ensayo.

La utilidad de la técnica de ELISA para cuantificar la respuesta a la vacunación contra clostridiosis debe ser analizada con mayor profundidad, a partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo.