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Introducción
Las resinas compuestas (RC) son materiales poliméricos ampliamente utilizados en la práctica odontológica. Los mismos tienen indicación para obturación directa e indirecta, cementado de restauraciones y brackets de ortodoncia, entre otras aplicaciones. El rendimiento clínico de estos materiales depende en gran medida de ciertas características esenciales, como buenas propiedades mecánicas, fácil manipulación, libres de toxicidad y no irritantes de los tejidos dentarios 1.
Se conoce como biocompatibilidad a la capacidad del material de convivir en armonía con el ambiente biológico circundante 2. Esto implica que el material restaurador no debe ser dañino para la pulpa ni los tejidos blandos, no debe contener sustancias tóxicas que puedan ser difundidas, liberadas y/o absorbidas por el ambiente en el que se encuentran, ni causar respuestas alérgicas o tener potencial carcinogénico 2,3. Para evaluar la toxicidad relativa de los materiales pueden emplearse múltiples ensayos que miden la viabilidad y el estado de proliferación de las células expuestas a materiales de prueba in vitro 2. Según la normativa internacional vigente (ISO 10993-5) 4, esta evaluación puede realizarse utilizando Bromuro3-(4,5dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltiazol o MTT. Siendo ésta la prueba más común para evaluar la citotoxicidad de los materiales dentales ya que es un método rápido y económico. Se basa en la reducción del metiltiazol tetrazolio en cristales de formazán por las células, por lo que su concentración medida espectrofotométricamente permite la cuantificación indirecta de las células viables 2.
Por otro lado, los valores de resistencia mecánica (traccional, compresiva o flexural), se utilizan como parámetro para evaluar el rendimiento de estos materiales poliméricos 5. La resistencia a la flexión (RF) es la propiedad mecánica recomendada por la Organización Internacional de Estandarización para el estudio de materiales basados en RC (ISO 4049:2009) 6. Este valor se obtiene mediante el ensayo de flexión en 3 puntos, donde el material se flexiona hasta su fractura. A su vez, este tipo de ensayo permite analizar el módulo elástico (ME) del material, es decir, que tan rígido o flexible es el mismo. Se ha demostrado que la RF es una prueba más selectiva y sensible a los cambios sutiles en una subestructura polimérica en comparación a la resistencia a la compresión 7.
El proceso de endurecimiento de las RC se lleva a cabo a través de una polimerización, lo que implica un pasaje de un estado monomérico a uno polimérico. Este proceso se realiza en la mayoría de los casos mediante activación por luz, para lo cual son necesarias unidades de fotopolimerización (UP) con una longitud de onda e intensidad específicas. Actualmente, las más utilizadas son unidades halógenas y unidades LEDs, con una longitud de onda entre 360 y 520 nm, siendo efectivas para la polimerización de materiales que utilicen como fotoiniciador la Canforoquinona 8.
Es de esperar que la totalidad de los dobles enlaces de carbono (C = C) del monómero de la matriz de las RC se conviertan en enlaces simples (C - C) formando la red polimérica 1. Sin embargo, el grado de conversión (GC) de monómeros a polímeros oscila entre el 55 a 75% 3, dependiendo esto de la estructura química de los monómeros, los tipos de relleno, la translucidez del material, el grosor de material a polimerizar, el tiempo, intensidad, densidad de la luz y la distancia entre la UP y el material 9. La relación entre la longitud de onda y el sistema fotoiniciador tiene un efecto decisivo sobre el GC de los monómeros. En la literatura, se ha establecido que para lograr un GC adecuado se requiere una exposición a la radiación (ER) entre 16-20 J/cm2 (8. La ER se establece mediante la potencia de la luz (mW/cm2) multiplicada por el tiempo de exposición (en segundos), por lo que para lograr un correcto GC debemos establecer un tiempo de exposición a la luz según la intensidad de nuestra UP 10. Dado que es necesaria una energía total de 16 J para lograr la correcta excitación del fotoiniciador; esta ER se logra, por ejemplo, teniendo una intensidad de luz mínima de 400 mw/cm2 por un tiempo de exposición de 40 segundos 2.
Sin embargo, la intensidad de las UP puede verse disminuidas por el deterioro de las lámparas y sus filtros, incorrecto mantenimiento, desgaste de la batería, residuos de resina en la punta de la UP, incorrecto uso de las mismas por colocar la fuente lumínica alejada del material a polimerizar, etc (q8). Esto resulta en la disminución del GC de la matriz orgánica, influyendo negativamente en las propiedades físico-mecánicas debido a un menor entrecruzamiento de las moléculas 3,9. De esta forma, sería esperable que el aumento de monómeros residuales genere una disminución de la biocompatibilidad, aumentando su capacidad citotóxica por la liberación de los mismos.
El control periódico de las UP, evaluando la intensidad de luz emitida mediante la utilización de radiómetros 11 resulta fundamental en la práctica clínica, dado que la falta de intensidad óptima de las UP es imperceptible clínicamente, pues aunque las RC sean fotopolimerizadas por debajo de los 16 J, al tacto presentan una consistencia rígida 2.
Por lo planteado anteriormente, el propósito del presente estudio fue determinar el efecto que produce la intensidad de la UP sobre la biocompatibilidad y resistencia a la flexión de una RC. Así como concientizar al profesional sobre la importancia del control periódico de sus UP.
Como hipótesis en este trabajo, se planteó que las RC polimerizadas con UP con intensidad <400 mW/cm2 serían más citotóxicas y tendrían menores valores de resistencia flexural y módulo elástico que aquellas que fueron curadas con intensidades mayores.
Metodología
El presente trabajo fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Odontología (UDELAR), número de expediente 091900000154-18.
Para el estudio se crearon 2 grupos según la intensidad de la UP:
-Grupo 1: Unidad GNATUS OPTILIGHT 600 (Gnatus; Ribeirao Preto, Brazil) con intensidad <400 mW/cm2 (exactamente 340 mW/cm2).
-Grupo 2: Unidad GNATUS OPTILIGHT MAX LED (Gnatus; Ribeirao Preto, Brazil) con intensidad >800 mW/cm2 (exactamente 860 mW/cm2).
La intensidad de las UP fue previamente medida utilizando un radiómetro Bluephase meter II (Ivoclar Vivadent; Schaan, Liechtenstein, Germany). Las UP se encontraban en funcionamiento y presentaban distinto uso y desgaste al momento del estudio.
Para realizar los ensayos de este estudio se utilizó una RC comercial Filtek Z250XT (3M ESPE, ST PAUL, MN, USA), la cual fue polimerizada con la UP según el grupo correspondiente, siguiendo las indicaciones del fabricante: 40 segundos con la unidad de fotopolimerización con intensidad <400 mW/cm2 y por 20 segundos con la unidad de fotopolimerización con intensidad >800 mW/cm2. La composición e indicaciones del fabricante se encuentran en la Tabla 1. Todas las manipulaciones fueron realizadas por un único operador entrenado.
Tabla 1: Características de resina compuesta Filtek Z250XT
| Nombre comercial | Fabricante | Composición | Indicaciones del fabricante |
| Filtek Z250XT (Color A2) | 3M ESPE | Matriz: Bis-GMA, Bis-EMA, TEGDMA, PEGDMA y UDMA. Relleno: Nanohíbrido (silice, zirconia, cluster de zirconia/silica). 82% de carga en peso. Silano. | Para 2 mm de espesor de material: - lámparas con intensidad hasta 800 mW/cm2, polimerizar por 40 segundos. - lámparas con intensidad mayor a 800 mW/cm2, polimerizar por 20 segundos |
Análisis de citotoxicidad
Preparación de la muestra
Para cada grupo se confeccionaron 5 cuerpos de prueba. Se colocaron moldes de acrílico de 5 mm de diámetro y 1 mm de profundidad sobre una lámina de acetato, se introdujo dentro del molde la RC y encima se colocó nuevamente una lámina de acetato presionada con una lámina de vidrio para asegurar la uniformidad de las muestras (Figura 1). Cada cuerpo se polimerizó según el grupo correspondiente. Finalmente, se retiraron de los moldes y los bordes se lijaron con lija de 400p con el fin de remover los posibles excesos.
Cultivo celular
Todos los procedimientos de cultivos se realizaron bajo estrictas normas de bioseguridad en cámara de flujo laminar FORMA 1300 A2, Modelo 1386 (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). Se utilizó una línea celular de fibroblastos inmortalizados de ratón (NIH 3T3) los cuales previamente fueron cultivados utilizando un medio de cultivo clonogénico (DMEM + 10% Suero Fetal Bovino + 1% Penicilina/Estreptomicina) (GIBCO, Dinamarca) en botellas de cultivo t25 dentro de una incubadora (FORMA 311, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) a 37ºC con 5% CO2 en humedad relativa.
Una vez alcanzada la confluencia del 80%, se realizó el pasaje a una botella de cultivo t75. Para este pasaje el medio de cultivo fue removido, las células fueron lavadas con buffer de fosfato salino (PBS) (GIBCO, Dinamarca), posteriormente se colocó 1 ml de tripsina/EDTA (TrypLE®, Thermofisher) por 5 minutos a 37ºC. Finalmente, la tripsina se neutralizó con 2 ml de medio clonogénico y toda la suspensión celular se colocó en una botella de cultivos t75, agregando medio clonogénico para continuar la expansión celular. Una vez alcanzada la confluencia del 80% se inició el ensayo de viabilidad celular.
Ensayo de viabilidad celular
El ensayo de viabilidad celular se realizó siguiendo un protocolo establecido anteriormente 12, cumpliendo con la normativa ISO 10993-5 4, (Figura 2). Cada cuerpo de prueba previamente confeccionado se colocó en un recipiente tipo Eppendorf® de 2 ml en donde se le agregó 1 ml de medio clonogénico y se dejó incubando por 24 horas. De esta manera, cualquier componente tóxico que contuviera la muestra se liberó a este medio de cultivo mediante lixiviación (eluato).
Las células previamente obtenidas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3x104 células por pozo incubadas durante 24 horas con 100 μl de medio clonogénico. De esta manera obtuvimos 6 columnas de 5 pozos por cada grupo: control negativo sin células, control positivo con células y medio clonogénico, y experimentales con el medio incubado en los cuerpos de prueba. Luego de las 24 horas, el DMEM se cambió en los pocillos de control, y en los pocillos experimentales se colocó 100 μl del medio previamente incubado (eluato) con los cuerpos de prueba.
La medición de viabilidad se realizó a las 24 y 48 horas de la siguiente manera: Primeramente, se retiró el medio de cultivo y los pocillos se lavaron con PBS. Seguidamente se colocaron 100 μl de medio clonogénico suplementado con 5% de MTT (GIBCO, Dinamarca) y se dejó incubando 5 horas a 37 ºC y 5% CO2. Finalmente se retiró el medio y se colocaron 100 μl de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Missouri, Estados Unidos) durante 5 minutos para revelar los precipitados bajo leve agitación.
Para la cuantificación de la viabilidad celular, se utilizó un espectrofotómetro ultravioleta visible de ELISA a 570 nm (Leytemed LTCM06 Elisa Microplate Reader, Guangzhou, China), lo que permitió cuantificar los precipitados. Estos precipitados generan una coloración violácea, que permite una medición indirecta de la metabolización del MTT, lo que indica la viabilidad de las células cultivadas. Una vez obtenidos los valores, se analizaron mediante la siguiente fórmula:
Análisis de flexión en 3 puntos
Para el análisis de la resistencia flexural y módulo elástico se realizó un ensayo de flexión en 3 puntos siguiendo la norma ISO 4049 6 (Figura 3).
Preparación de las muestras
Se confeccionaron 10 cuerpos de prueba en forma de barra (25 x 2 x 2 mm) por grupo, colocando el material resinoso sin polimerizar en un molde de acrílico cubierto por una tira de celuloide y presionando con un portaobjetos de vidrio, la polimerización de estos bastones se realizó siguiendo el método de superposición descrito en la normativa ISO 4049 6.
Una vez polimerizadas, se retiraron del molde y se eliminaron los excesos utilizando una lija 400p. Cada cuerpo de prueba se midió utilizando un calibre digital (Mitutoyo, Japón) con una precisión de 0.01 mm. Previo al ensayo mecánico, las muestras se almacenaron en agua destilada a 37 °C durante 24 horas.
Ensayo mecánico
El ensayo mecánico se realizó utilizando una máquina de ensayos universales MTS SANS CMT2000 (Sans Testing Machine, Shen Zhen, China) con una celda de carga de 5 kN y una velocidad de cruceta de 0,75 mm/s hasta su fractura. Para determinar la resistencia flexural (σ) y el módulo elástico (E) se utilizaron las siguientes ecuaciones:
Donde P es la carga en el momento de la fractura (N), l es la distancia entre los soportes (20 mm), b es el ancho (mm) y h es la altura del cuerpo de prueba (mm), P1 es la carga máxima en la porción lineal (límite proporcional) de la gráfica tensión-deformación, y d es la deformación del espécimen en la carga P1 6.
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos sobre viabilidad celular fueron analizados mediante test de ANOVA de dos vías, analizando los factores: a) UP utilizada y b) momento del análisis (24 o 48 horas). Los resultados de resistencia flexural y módulo elástico fueron analizados mediante test de Student. Todos los resultados fueron sometidos previamente a test de normalidad y el nivel de significancia en todos los análisis fue de α = 0,05. Para realizar este análisis estadístico se utilizó el software SigmaStat v3.5 (Systat Software, California, Estados Unidos).
Resultados
Viabilidad celular
Al evaluar los resultados de viabilidad celular (Figura 4) podemos observar que existe una diferencia estadísticamente significativa (p<0,001) entre los grupos estudiados, presentando mayores grados de citotoxicidad al utilizar una intensidad <400 mW/cm2. A su vez, el análisis de dos vías reveló una diferencia estadística al evaluar la citotoxicidad a las 24 y 48 hs (p<0,001).
Tabla 2: Tabla de resultados del ANOVA de dos vías
| Fuente de Variación | Grados de Libertad | Suma de los cuadrados | Media de la suma de los cuadrados | F | P valor |
| Intensidad | 1 | 5000,374 | 5000,374 | 150,416 | <0,001 |
| Tiempo | 1 | 2163,613 | 2163,613 | 65,083 | <0,001 |
| Intensidad x Tiempo | 1 | 132,134 | 132,134 | 3,975 | 0,057 |
| Residual | 25 | 831,091 | 33,244 | ||
| Total | 28 | 8477,913 | 302,783 |
Análisis de flexión en 3 puntos
Al analizar la resistencia flexural (Figura 5) se observa que existe una diferencia estadísticamente significativa (p=0,02) entre <400 y >800 mW/cm2.
En cuanto al módulo elástico (Figura 5) también se observa una diferencia estadísticamente significativa (p=0,037) entre <400 y >800 mW/cm2. Presentando mayores valores de resistencia flexural y módulo elástico al utilizar una unidad de >800 mW/cm2.
Discusión
En el presente estudio se evaluó el efecto de la intensidad de dos UP LED sobre las propiedades mecánicas y biológicas de una RC, ya que clínicamente no es posible corroborar su correcta polimerización. Los resultados mostraron diferencias significativas en cuanto a viabilidad celular, resistencia flexural y módulo elástico, dependiendo de la intensidad utilizada. Para el grupo fotopolimerizado con mayor intensidad tanto la viabilidad celular como sus propiedades mecánicas fueron estadísticamente superiores en comparación al grupo fotopolimerizado con una unidad de menor intensidad. Considerando esto, nuestra hipótesis de trabajo puede ser aceptada.
La biocompatibilidad de los materiales dentales ha sido investigada en la literatura a través de diferentes métodos, tales como pruebas para estimar la cantidad de ácidos ribonucleicos y el daño en sus cadenas 13, estudios que evalúan la gravedad de acción proteolítica 14, evaluación del nivel de glutatión en las células 15 y evaluación de actividad metabólica (por ejemplo, ensayos con MTT) 9, entre otras. Para este estudio, se seleccionó el ensayo con MTT, debido a que a pesar de existir otros métodos, este es un buen indicador de la viabilidad celular y es el método indicado por la normativa internacional vigente para el análisis de biomateriales de uso odontológico 4. En el presente estudio se observó una disminución significativa de la viabilidad celular a las 24 hs (93,1% Grupo 2, 70,6% Grupo 1) y 48 hs (79,8% Grupo 2, 48,5% Grupo 1) respecto al control celular (100%), siendo estos datos relacionados con los encontrados en la literatura 9. Resulta relevante, considerar que según la normativa ISO 10993-5, la reducción de la viabilidad celular en más del 30% se considera un efecto citotóxico 4.
Los niveles de citotoxicidad en materiales resinosos pueden ser relacionados con la degradación gradual en el tiempo, liberando cada vez más componentes tóxicos al medio, por lo que ésta es dependiente del tiempo y la concentración del componente principal de estos materiales, el monómero Bis-GMA 9. Diversos autores han analizado la citotoxicidad del Bis-GMA presente en materiales de uso odontológico, exponiendo fibroblastos a concentraciones diferentes de Bis-GMA 1,16, demostrando que existe una respuesta dosis dependiente a través del tiempo, donde a mayor concentración de Bis-GMA existe una menor viabilidad celular 3. Schubert et al, demostraron que el efecto citotóxico del material también puede verse afectado notablemente por el tono de color del material, observando una mayor citotoxicidad en resinas color C2 en comparación con los tonos A2 15. Esto podría explicarse debido a que el GC se ve afectado por pigmentos metálicos, como Cu2 +, Al3 + y Fe2+, utilizados en los tonos de resina más oscuros 17. Algunos estudios establecen que el Bis-GMA está entre los componentes más tóxicos debido a su liposolubilidad, seguido por UMDA, TEGDMA y HEMA 18,19. Además, se observaron efectos sinérgicos cuando se probaron combinaciones de TEGDMA con UDMA o particularmente con Bis-GMA 8. Gonçalves y col., compararon el efecto citotóxico de resinas en su presentación convencional y fluida demostrando que los compuestos fluidos eran severamente más tóxicos que los de consistencia media, lo cual podría deberse a que las presentaciones fluidas contienen más cantidad de monómero y menos relleno en su composición 20. Estudios in vitro han demostrado que la reacción de polimerización nunca es completa, sino que oscila entre el 50 y 70% de la matriz 9, como ya fue explicado anteriormente, esto podría verse afectado a su vez por un incorrecto protocolo de polimerización, disminuyendo el GC 10,16.
Con relación al comportamiento mecánico, diversos estudios han demostrado que una intensidad y energía insuficiente, disminuyen significativamente el GC de las RC 19,21. Además, existe una correlación significativa entre GC y las propiedades mecánicas como dureza, módulo de elasticidad y resistencia a la flexión de RC 22. De este modo, era de esperarse que en los resultados del presente estudio, el grupo polimerizado con una UP >800 mW/cm2 presentara un comportamiento mecánico superior, ya que su GC sería mayor, respecto al grupo polimerizado con una UP <400 mW/cm2. A pesar de que el tamaño del relleno y composición de la matriz polimérica pueden influir en el GC 2,11, en este estudio solo se utilizó un tipo de RC (Z250XT) por lo que el control de esta variable permite aseverar que la diferencia en las propiedades mecánicas fue debido a la variación de la intensidad de las UP, por ende el GC disminuye a causa de una menor ER 10,21.
Por otro lado, algunos estudios han demostrado que el módulo de elasticidad disminuye si se aumentan las moléculas lineales dentro de la estructura polimérica 23. Por lo que, podemos inferir que las muestras polimerizadas con una UP <400 mW/cm2 presentaron una estructura polimérica más lineal, respecto a las polimerizadas con una UP >800 mW/cm2 las cuales presentaron una estructura más ramificada. Además, existe una relación entre GC, estructura espacial y la sorción acuosa de las RC lo que favorece la difusión de monómeros sin reaccionar a los tejidos orales aumentando la toxicidad de las mismas 2, lo cual también podría explicar las diferencias entre la citotoxicidad de ambos grupos.
Con respecto a los efectos adversos de una incorrecta polimerización, estudios han demostrado una relación estricta entre las propiedades del material restaurador y su sobrevida 24. De esta forma, no solo se vería afectado el comportamiento mecánico del material, sino también la estabilidad de color y la estética 25. Además, esto aumentaría la solubilidad de las RC 26 causando una mayor rugosidad superficial y la formación de biopelículas 27, aumentando el riesgo de caries. Por lo que se desaconseja utilizar UP con una intensidad <400 mW/cm2 con el fin de disminuir la probabilidad de detrimento de la RC.
Como limitaciones del estudio, debemos considerar que el mismo es in vitro, por lo que el comportamiento clínico podría variar. Se necesitan más estudios clínicos que respalden estos resultados. Además, se debe remarcar que el estudio utilizó una sola RC por lo que es factible que los resultados se vean alterados para otro tipo de RC.
Los datos obtenidos en el presente trabajo sugieren que el uso de una UP con una intensidad de <400 mW/cm2 genera una disminución de las propiedades físico-mecánicas y biológicas de las RC, por lo tanto un menor GC, lo que toma relevancia clínica debido a que existe una relación entre las propiedades del material y su desempeño clínico 22,24. Resulta de gran importancia conocer la intensidad de nuestra UP para establecer el tiempo de irradiación y así lograr un adecuado GC 8,23. En la literatura se ha relatado que la intensidad de la luz de la UP puede verse afectada a lo largo del tiempo por deterioro de la unidad, puntas de fibra sucias o astilladas 11,21,23, por lo que es importante realizar el control periódico de las UP con un radiómetro digital. Por otro lado, es importante conocer las indicaciones de los fabricantes, composición de las RC y de las longitudes de onda que presente nuestra UP, a modo de que el perfil de emisión de la UP incluya las longitudes de onda que cubran el perfil de absorbancia de los fotoiniciadores utilizados en la RC.
Conclusión
En base a los resultados expuestos, podemos concluir que una intensidad de polimerización <400 mW/cm2, genera un aumento en los niveles de citotoxicidad y una disminución significativa en las propiedades mecánicas de las resinas compuestas.
Los autores consideran que esta situación puede pasar desapercibida a corto plazo en la clínica odontológica, por lo que cabe destacar la importancia del control periódico de la intensidad de las unidades de fotopolimerización. La falta de controles, el uso de intensidades insuficientes, así como la aplicación de protocolos inadecuados ya sea por la técnica de aplicación o tiempos inferiores a lo necesario traerán como consecuencia la falla prematura de la restauración, y un posible efecto biológico irreversible.
