Introducción y Antecedentes

Los virus del papiloma humano (VPH) tienen un tropismo por el epitelio escamoso ¹. Las partículas virales infectan las células basales del epitelio, que quedan expuestas a través de microabrasiones o heridas epiteliales. Los receptores del VPH y el modo de entrada viral en la célula aún son desconocidos mayoritariamente. Sin embargo se ha señalado que la participación de los glucosaminoglucanos, proteoglucanos y glipicanos podrían actuar como receptores de unión en la superficie de la célula ^2,3.

Las manifestaciones de las infecciones por VPH pueden ser múltiples, las cuales pueden variar de una infección asintomática, una lesión papilomatosa o verrucosa benigna, lesiones potencialmente malignas, neoplasia intraepitelial e inclusive carcinomas invasivos ³.

La variedad de estas lesiones y su comportamiento se deben a la diversidad genotípica encontrada en la configuración molecular del VPH, (los cuales hasta la realización de este trabajo se conocen aproximadamente 200 tipos y suelen diferenciarse entre VPH de alto riesgo (AR) y bajo riesgo (BR) con base en la interacción con oncogenes relacionados a la carcinogénesis) ^3,4.

Las lesiones por VPH no son consideradas dentro de los desórdenes potencialmente malignos ⁵, porque generalmente son provocadas por VPH-BR. Sin embargo, se considera que cualquier agente que ocasiona el aumento de la proliferación celular aumenta el riesgo de transformación neoplásica ⁶.Además tres datos obtenidos recientemente obligan a evaluar la posibilidad de transformación neoplásica de las lesiones verrucopapilares de la cavidad oral (LVPO); 1) se ha reportado un aumento en la co-infección por VPH-AR con VPH-BR en citologías cervicales con presencia de neoplasia intraepitelial en cualquiera de sus grados ⁷. 2) la displasia epitelial oral asociada al virus del papiloma humano (VPH-DEO) se incorporó recientemente la 5ta Clasificación de la OMS de los tumores de cabeza y cuello, como un tumor de distinto tipo de displasia oral caracterizada por una arquitectura típica con cambios arquitecturales y citológicos causados por VPH-AR ^8,9) y 3) los factores de riesgo asociados al carcinoma oral de células escamosas en adultos jóvenes incluye la infección por el virus del papiloma humano ^10,11.

Dentro de los métodos adyuvantes utilizados como auxiliar en la selección de lesiones con riesgo de malignización, el de mayor acceso a nivel mundial y con mejores porcentajes de sensibilidad y especificidad reportados es el azul de toluidina (AT) ^12,13. Esta tinción supravital se ha utilizado para resaltar lesiones orales potencialmente malignas y poder identificar lesiones tempranas, que podrían pasar desapercibidas en el examen clínico ^14,15. El AT (también conocido como cloruro de tolonio) es un colorante metacromático acidófilo que tiñe selectivamente los componentes ácidos del tejido, por lo que tiene afinidad por los ácidos nucleicos y, por lo tanto, se une al material nuclear de los tejidos con un alto contenido de ADN y ARN ¹⁵.

Richart propuso por primera vez el uso del AT como tinción vital para revelar displasia y carcinoma in situ del cuello uterino. Neibel y Chomet y Shedd y colaboradores fueron los primeros en informar sobre la aplicación vital de AT para la detección de lesiones premalignas y malignas de la cavidad bucal. Ellos confirmaron la propiedad de AT para verificar lesiones clínicamente sospechosas como neoplásicas, así como para delimitar márgenes de lesiones premalignas y crecimiento maligno, y detectar tumores satélites o inadvertidos ¹⁶.

El marcador ampliamente aceptado para evaluar el riesgo de que un trastorno potencialmente maligna oral (TPMO) eventualmente sufra transformación maligna, es la presencia y el grado de displasia histopatológica en la lesión. La displasia se define como cambios arquitectónicos y citológicos epiteliales específicos, secundarios a la pérdida de maduración normal y estratificación ¹⁷.

Se han propuesto diversos enfoques para la graduación de la displasia epitelial oral (DEO), pero se reconoce que el sistema binario, que clasifica en baja o alto grado de displasia, es el que presenta menor ambigüedad ^17,18.

Hasta ahora no existen estudios que haya evaluado ambos métodos en LVPO por lo que se desconoce si estos cuentan con algún riesgo de transformación maligna. Por lo que el objetivo del presente trabajo es evaluar la positividad con el azul de toluidina y los cambios histológicos de displasia en LVPO.

Materiales y Métodos

En la clínica de patología y medicina bucal de la Universidad de Guadalajara se captaron pacientes con lesiones detectadas clínicamente por especialistas en el área como LVPO con la aplicación de los siguientes criterios de inclusión: lesiones de primera vez no asociadas a algún síndrome o condición hereditaria con la aceptación de consentimiento informado o asentimiento en pacientes menores de edad. Dentro de los criterios de eliminación se consideraron a los pacientes que no accedieron a la aplicación del azul de toluidina o no continuaron el proceso para la evaluación histopatológica, así como muestras que no contaron con el daño citopático (coilocitos) asociado a la presencia de VPH . El proyecto de investigación fue aprobado por el comíte de ética e investigación de la Universidad de Guadalajara CI-04219.

Resultados

De los 34 casos incluidos en el estudio, 23 (67,6%) correspondieron al sexo masculino y 11 (32,3%) al sexo femenino con un promedio de edad de 32,4 años. La localización más frecuente fue paladar duro o blando con 12 (35,3%) casos ubicados en esta zona. La siguiente zona anatómica oral afectada con mayor frecuencia fue la encía con 9 (26,5%) casos mientras que las ubicaciones con menores frecuencias fueron la lengua en la que se identificaron 7 casos (20,6%) y la orofaringe con 6 (17,6%) casos.

Cuatro casos al realizar la tinción intravital mostraron la retención del reactivo dando un espectro azul sobre el tejido de la lesión. Tres fueron interpretadas en un espectro azul intenso a la absorción del AT (Imagen 1A, B y C) y 1 caso se determinó como leve (Imagen 2D) .

Imagen 1. Positividad al AT de LVPO. A) LVPO en paladar blando que muestra coloración azul intensa (+) a la tinción por AT B) LVPO en paladar duro en el margen gingival que muestra mayor intensidad del azul (+) en las hendiduras de la placa verrucosa C) LVPO en orofaringe con espectro intenso del azul en la totalidad de la lesión D) LVPO de intensidad leve (+) en vientre de lengua. 

Referente a los cambios displásicos arquitectónicos, se observó apariencia verrucosa o papilar en todos los casos (Imagen 2A). El siguiente cambio displásico que se detectó fue la pérdida de la polaridad del núcleo (Imagen 2B), presente en 4 casos (11,8%).

Se reconocieron cambios displásicos citológicos, de los cuales el hipercromatismo nuclear (Imagen 2C) tuvo mayor presencia en 16 (47,0%) de los casos, seguido por la alteración en la relación núcleo-citoplasma (Imagen 2D) en 14 (41,2%) muestras. En menor proporción fue posible apreciar aumento en el tamaño y número de nucleolos (Imagen 2E), en 4 lesiones de los casos analizados (11,8%) y variación en el tamaño de la célula en 1 caso (Imagen 3E) (2,9%).

Imagen 2. Cambios displasicos en LVPO. Arquitecturales: A apariencia verrucosa o papilar B) perdida de la polaridad del núcleo de las células basales. Citológicos: C) hipercromatismo nuclear D) alteración en la relación núcleo-citoplasma E) aumento en el tamaño y número de nucleolos F) variación en el tamaño de la célula. Las magnificaciones se encuentran a 4, 10 y 40 x 

Debido a la hiperplasia provocada por el VPH, todas las lesiones contaron con al menos 1 cambio displásico arquitectural hasta 6 cambios displásicos ya sea citológico y/o arquitecturales, que de acuerdo a la imagen 4 fueron las lesiones positivas a AT las que contaron con mayor número de cambios citológicos a diferencias de las negativas las cuales se concentraron en 1 a 3 cambios displásicos.

Imagen 3. Sumatoria de cambios celulares y arquitecturales agrupados de acuerdo al resultado de la tinción intravital. El grupo de lesiones negativas a la tinción mostraron una frecuencia descendente conforme se aumentaba la cantidad de cambios arquitecturales o celulares (flecha morada), contrario a las lesiones positivas, donde la frecuencia asciende a mayor número de cambios (flecha naranja). 

Dados los datos recabados, se clasifican los casos en displasia epitelial de bajo grado.

Discusión

El desarrollo del carcinoma oral de células escamosas ocurre en un proceso multietapas a partir de la hiperplasia epitelial inicial que puede progresar hacia un carcinoma invasivo ²¹.

Hasta ahora no existían estudios que hayan utilizado métodos previamente establecidos para la identificación de lesiones con cambios displasicos en el tamizaje clínico e histopatológico.

El AT se basa en que las células displásicas y neoplásicas pueden contener cuantitativamente más ácido nucléico que los tejidos normales. Además, el epitelio maligno puede contener canales intracelulares más anchos que el epitelio normal, lo que puede facilitar la utilización del AT ²². Las otras propuestas sobre la adopción del AT en los carcinomas y tejidos displásicos incluye la alta densidad del material nuclear, la pérdida de cohesión celular y aumento de la mitosis ²³.

Este es el primer estudio que expone imágenes de LVPO positivas al AT. La positividad por el AT en las LVPO se puede adjudicar a la sumatoria de características displásicas que pueden estar presentes en el tejido infectado, pues como se observó en los resultados las LVPO positivas pueden presentar (hasta 6 cambios displásicos). Algunos casos presentaron en conjunto hipercromatismo nuclear, aumento en la relación núcleo-citoplasma, aumento en el tamaño y número de nucleolos, variación en el tamaño de la célula, apariencia verrucosa o papilar y pérdida de la polaridad del núcleo. Además, las lesiones que tiñeron son las que presentaron el aumento en el tamaño y número de nucleolos, lo cual representa la alta actividad mitótica. Pero esto no es posible demostrarlo en la totalidad con la evaluaciòn histopatológica, y aunque el sitema binario es una herramienta útil para el riesgo de transformación maligna, no esta esclarecido cuales elementos arquitectonicos o citologicos son los que se asocian directamente a un proceso de carcinogenesis. En la actualidad para valorar la actividad mitótica asì com la infección por VPH es necesario sumar métodos moleculares con la presencia del inmunomarcador ki67 para conocer el indice mitótico ²⁴ y en el caso de la infección se requiere el reconocimiento de ADN viral perteneciente al VPH ²⁵.

Aunque la gradificación estableció que todas las lesiones se encontraban en bajo riesgo, se enfatiza que este resultado no implica la inexistencia de riesgo, ya que se ha demostrado que lesiones positivas a AT muestran alteraciones genéticas asociadas a la perdida de heterocigosidad en múltiples sitios del material genético, evento frecuentemente implicado en las multietapas de carcinogénesis del cáncer de cabeza y cuello ²⁶.

En nuestra búsqueda sólo se encontró un trabajo en el cual se evaluó la posibilidad del riesgo de malignidad a través de la evaluación por la detección de genotipos de VPH-AR y VPH-BR presentes en los papilomas escamosos de la cavidad oral, así como el marcaje de proliferación celular por ki67. Tales investigadores al contrastar con tejidos tumorales con cáncer oral y de orofaringe, obtuvieron en sus resultados que los VPH-AR sólo se presentaban en los tejidos malignos y que el marcaje de ki67 no se podía considerar positivo para las lesiones por VPH ²⁷. A pesar de utilizar una metodología muy sofisticada, en cavidad oral, la tinción por AT es de acceso fácil y puede ser realizado por cualquier especialista en el área de la salud. De igual manera la evaluación de datos displásicos pueden ser descritos en el reporte histopatológico.

No obstante el presente trabajo, no cuenta con el suficiente tamaño de muestra para determinar la sensibilidad o especificidad del AT en predecir la transformación maligna, así como descartar la posibilidad de encontrar LVPO con características displásicas gradificadas en alto riesgo. Pero este estudio prueba que el daño por VPH en los tejidos orales no es autolimitado y homogéneo, que pueden existir lesiones positivas al AT y presentar uno o más cambios displásicos. Es importante considerar que la tinción con azul de toluidina puede revelar alteraciones citológicas que son difíciles de detectar clínicamente. Sin embargo, estas alteraciones no siempre están relacionadas con una transformación maligna. A pesar de esto, no se debe desestimar completamente el uso del azul de toluidina para el monitoreo del cáncer bucal, ya que la técnica presenta una alta sensibilidad. La baja especificidad se atribuye a la elevada tasa de falsos positivos, a menudo causada por una interpretación incorrecta del contexto clínico ²⁸. Sin embargo, estos resultados pueden servir de precedente para futuros estudios, ya que no se desestima totalmente el uso del azul de toluidina para.

Conclusión

Las LVPO pueden emitir una tinción positiva al azul de toluidina así como presentar una variedad heterogenea de cambios displásicos arquitecturales y citológicos evaluados histopatologicamente. Sin embargo se requieren investigaciones con mayor tamaño de muestra para analizar el riesgo de transformación maligna.